Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Označenie:: 1/1998
Stav:: Zrušený
Jazyk textu:: cs

2.2.24 Absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti ⟪MEDIA:img_001⟫

Spektrofotometry v infračervené oblasti se používají pro záznam spekter v oblasti od 4000 cm -1 do 670 cm -1 (2,5 μm až 15 μm) nebo v některých případech až do 200 cm -1 (50 μm). Spektrofotometry s Fourierovou transformací využívají polychromatické záření a Fourierovou transformací se převádí spektrum z původních dat do frekvenční reprezentace. Mohou být také použity spektrofotometry opatřené optickým systémem schopným vytvářet monochromatické záření v měřené oblasti. Normálně je spektrum dáno jako funkce transmitance, poměrem intenzity propuštěného a dopadajícího záření.

Absorbance A je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T a je vyjádřena vztahem:

A=log10⁡1T=log10⁡I0I,

v němž značí:

T - I/I 0 ,

I 0 - intenzitu dopadajícího monochromatického záření,

I - intenzitu prošlého monochromatického záření.

Příprava vzorku

Pro záznam s využitím propustnosti nebo absorpce. Látka se upraví jedním z následujících postupů.

Kapaliny. Kapalina se zkouší buď jako film mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření, nebo v kyvetě vhodné tloušťky rovněž propustné pro infračervené záření.

Kapaliny nebo pevné látky v roztoku. Připraví se roztok ve vhodném rozpouštědle. Zvolí se koncentrace a tloušťka kyvety tak, aby se získalo vhodné spektrum. Dobré výsledky se zpravidla získají s koncentracemi od 10 g/l do 100 g/l pro tloušťku kyvety 0,5 mm až 0,1 mm. Absorpce způsobená rozpouštědlem by měla být kompenzována vložením podobné kyvety s použitým rozpouštědlem do referenčního paprsku.

Pevné látky. Pevné látky se zkoušejí dispergované ve vhodné kapalině (suspenze) nebo v pevné látce (halogenidová tableta) podle toho, co je vhodnější. Je-li to v článku předepsáno, připraví se film z taveniny mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření.

(a) Suspenze. Rozetře se malé množství zkoušené látky s minimálním množstvím tekutého parafinu R nebo jiné vhodné kapaliny; k přípravě vhodné suspenze stačí zpravidla 5 mg až 10 mg zkoušené látky. Suspenze se stlačí mezi dvě destičky propustné pro infračervené záření.

(b) Tableta. Není-li uvedeno jinak, rozetřou se 1 mg až 2 mg zkoušené látky s 300 mg až 400 mg jemně práškovaného a vysušeného bromidu draselného R nebo chloridu draselného R. Tato množství postačují zpravidla k přípravě tablety o průměru 13 mm a k získání spektra vhodné intenzity. Směs se pečlivě rozetře, stejnoměrně se jí naplní vhodná forma a slisuje se ve vakuu tlakem asi 800 MPa (8 t.cm -2 ). Z různých příčin mohou vzniknout špatné tablety: např. nedostatečné nebo přílišné roztírání, vlhkost nebo jiné nečistoty v dispergujícím prostředí a nedostatečné rozmělnění částeček. Tableta se nepoužije, vykazuje-li při vizuální kontrole nejednotnou propustnost, nebo je-li transmitance při asi 2000 cm -1 (5 μm) v nepřítomnosti specifického absorpčního pásu menší než 75 % bez kompenzace.

Plyny. Plyny se zkoušejí v kyvetě propustné pro infračervené záření mající optickou dráhu asi 100 mm. Kyveta se evakuuje a naplní se na požadovaný tlak pomocí kohoutu nebo jehlového ventilu při použití vhodné trubice pro převod plynu mezi kyvetou a nádobou obsahující zkoušenou látku. Je-li to nutné, upraví se tlak v kyvetě na tlak atmosférický použitím plynu propustného pro infračervené záření (např. dusíku R nebo argonu R). K odstranění interference absorpce způsobené vodou, oxidem uhličitým nebo jinými atmosférickými plyny se vloží do referenčního paprsku stejná kyveta, která je buď evakuována, nebo naplněna plynem propustným pro infračervené záření.

Pro záznam s využitím mnohonásobné reflexe

Je-li tento záznam předepsán v článku, upraví se látka jednou z následujících metod.

Roztoky. Látka se rozpustí ve vhodném rozpouštědle za podmínek uvedených v článku. Roztok se odpaří na thalliumbromido-jodidové destičce nebo na jiné vhodné destičce.

Pevné látky. Látka se homogenně rozprostře na thalliumbromido-jodidové nebo jiné vhodné destičce.

Identifikace s použitím referenčních látek

Stejným způsobem se upraví jak zkoušená, tak i referenční látka a za stejných podmínek se zaznamenají spektra od 4000 cm -1 do 670 cm -1 (2,5 μm až 15 μm). Minima propustnosti (absorpční maxima) spektra zkoušené látky odpovídají polohou i relativní intenzitou hodnotám referenční látky (CRL).

Vykazují-li spektra zaznamenaná v pevném stavu rozdíly v polohách minim propustnosti (absorpčních maxim), zpracuje se stejným způsobem zkoušená i referenční látka tak, aby vykrystalizovaly nebo vznikly ve stejné formě, nebo se postupuje tak, jak je předepsáno v článku, a pak se zaznamenají spektra.

Identifikace s použitím referenčních spekter

Kontrola rozlišovací schopnosti. Zaznamená se spektrum 0,04 mm silného polystyrenového filmu. Rozdíl x (viz obr. 2.2.24-1) mezi procenty transmitance při maximu propustnosti A při 2870 cm -1 (3,48 μm) a minimu propustnosti B při 2849,5 cm -1 (3,51 μm) by měl být větší než 18. Rozdíly mezi procenty transmitance při maximu propustnosti C při 1589 cm -1 (6,29 μm) a minimu propustnosti D při 1583 cm -1 (6,32 μm) by měl být větší než 12.

Ověření stupnice vlnočtů. Stupnice vlnočtů může být ověřena použitím polystyrenového filmu, který má minima propustnosti (absorpční maxima) při vlnočtech v cm -1 uvedených v tab. 2.2.24-1.

Tab. 2.2.24-1 Minima propustnosti (a přijatelná tolerance) polystyrenového filmu v cm -1 .

⟪TABLE:tbl_001⟫

Pracovní postup. Zkoušená látka se připraví podle návodu uvedeného u referenčního spektra. Za pracovních podmínek, které byly použity při kontrole rozlišovací schopnosti, se zaznamená spektrum zkoušené látky a na něj se superponují absorpční pásy polystyrenu při 2849,5 cm -1 (3,51 μm), 1601,2 cm -1 (6,25 μm) a 1028,3 cm -1 (9,72 μm). Porovnají se obě spektra a maxima polystyrenu uvedená výše. Použijí-li se polohy maxim polystyrenu jako referenční hodnoty, pak polohy význačných maxim spektra zkoušené látky musí odpovídat význačným maximům referenčního spektra s odchylkou nejvýše 0,5 % vlnočtové stupnice. Relativní intenzity maxim obou spekter by měly být shodné.

Nečistoty v plynech

Pro analýzu nečistot v plynech se použije kyveta propustná pro infračervené záření s vhodnou optickou dráhou (např. 1 m až 20 m). Naplní se způsobem uvedeným v odstavci Plyny. Detekce a kvantifikace nečistot se provede podle postupu uvedeného v článku.

⟪MEDIA:img_001⟫

Obr. 2.2.24-1 Typické spektrum polystyrenu používané při kontrole rozlišovací schopnosti

b 0,5a a b 0,5b šířky píků v polovině jejich výšky (mm).

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin s epoxy-, hydroepoxy-, cyklopropyl- a cyklopropenylovými skupinami nebo pro oleje s velkým podílem mastných kyselin s kratším řetězcem než 8 uhlíkových atomů nebo pro oleje s vyšším číslem kyselosti než 2. Provede se plynová chromatografie (2.2.28) (náplňová kolona nebo kapilární kolona).

Přístroj ke zkoušce se vybírá podle fyzikálně-chemických charakteristik zkoušené lékové formy.

Přednostně je vhodné použít přístroj, který umožňuje pozorování přípravku a míchání během zkoušky.

Bezbarvá kapalina.

Uchovává se chráněn před světlem.

Kapalina, prakticky nerozpustná ve vodě, mísitelná s lihem 96 %.

Bílé jehličkovité krystaly, dobře rozpustné ve vodě a methanolu, těžce rozpustné v ethanolu, prakticky nerozpustné v acetonu a etheru.

TT: asi 160 °C.

Bezbarvá kapalina, prakticky nerozpustná ve vodě, dobře rozpustná v lihu 96%.

Téměř bílý nebo nažloutlý krystalický prášek.

Bezbarvá kapalina.

Uchovává se ve vzduchotěsných obalech, chráněna před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.

Žluté krystaly.

Uchovává se ve vzduchotěsných obalech.

Bílý krystalický prášek, snadno rozpustný ve vodě.

Bezbarvá olejovitá kapalina.

Uchovává se chráněn před světlem.

Zelené krystaly s kovovým leskem, velmi dobře rozpustné ve vodě na roztok modrozelené barvy, dobře rozpustné v lihu 96% a v methanolu.

Smíchá se roztok A, roztok B a 1,5 ml roztoku C.

38,9 ml roztoku I a 61,1 ml roztoku II se smíchá, a je-li třeba, upraví se pH (2.2.3).

⟪TABLE:tbl_001⟫

⟪MEDIA:img_001⟫

Dávky:

⟪TABLE:tbl_001⟫

v němž značí:

⟪TABLE:tbl_001⟫

Separandum.

1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 17,22 mg CaSO 4 . 2H 2 O

Anethol. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) dvě zřetelně oddělené hlavní skvrny.

Pro každou složku se vypočítá odezvový faktor R x ze vzorce:

Účinnost se vypočítá běžnou statistickou metodou pro párový křížový pokus.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku nebyla menší než 50 % stupnice zapisovače.

Bílkoviny.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku nebyla menší než 50 % rozsahu celé stupnice zapisovače.

Chloridy (2.4.4). 2,5 ml roztoku S se zředí vodou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

A je -0,3 ml až +0,3 ml pro 0,3500 g zkoušené látky.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Nastříkne se odděleně po 1 μl každého roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) se ověří, že není přítomen žádný pík s retenčním časem stejným, jako má vnitřní standard. Vypočítá se obsah methanolu a 2-propanolu za použití hustoty při 20 °C, která je pro methanol 0,792 g/ml a 0,785 g/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Porovnávací roztok. 20 mg primachininiumdifosfatu CRL se rozpustí v 5 ml vody R a zředí se methanolem R na 10 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Chromatografický postup se provádí obvykle za použití:

Porovnávací roztok (c). 2,0 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí methanolem R na 100 ml.

Porovnávací roztok (d). 1,0 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí methanolem R na 100 ml.

Porovnávací roztok (e). 0,5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí methanolem R na 100 ml.

Porovnávací roztok (f). 10 mg ranitidinu nečistoty A CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 100 ml.

Uchovávání

Zkouška na neškodnost (2.6.9). Každé myši se vstříknou 4 mg rozpuštěné v 0,5 ml vody na injekci R.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 18,32 mg C 7 H 5 NO 3 S.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Vzhled roztoku v hydroxidu sodném 1 mol/l. 1,25 g se rozpustí mírným zahřátím ve 25 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS. Roztok je čirý (2.2.1). Absorbance (2.2.25) tohoto roztoku měřená při 420 nm ve 4cm vrstvě je nejvýše 0,15.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Zkoušený roztok. 1,0 g práškované drogy (355) se smíchá s 10 ml methanolu R a zahřívá se 5 min ve vodní lázni při 60 °C pod zpětným chladičem. Po ochlazení se zfiltruje.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Uchovávání

Vhodné metody zahrnují:

Výsledek se vyjádří v hmotnostních procentech nebo v gramech na litr.

Vyhovují požadavkům článku Tampona medicata.

v nemž značí:

Stanovení zkušební dávky toxinu. Ve vhodné tekutině se připraví roztok referenčního přípravku tak, aby v 1 ml obsahoval 5 m.j. beta-antitoxinu Clostridium perfringens a 0,5 m.j. epsilon- antitoxinu Clostridium perfringens.

Roztok zkušebního toxinu ve vhodné tekutině se připraví tak, aby 1,0 ml obsahoval přesně známé množství, tj. 10 mg pro beta-toxin a 1 mg pro epsilon-toxin. Připraví se směsi roztoků referenčního přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku referenčního přípravku a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a nechají se 30 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši hmotnosti 17 g až 22 g a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Uhynou-li všechny myši, je množství toxinu obsažené v 0,5 ml směsi vyšší než zkušební dávka. Neuhyne-li žádná myš, je množství toxinu obsažené v 0,5 ml směsi nižší než zkušební dávka. Potom se připraví čerstvé směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku referenčního přípravku a jeden z řady stoupajících objemů zkušebního toxinu (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod). Směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se nejméně 72 h. Zkouška se nejméně jedenkrát opakuje a výsledky u jednotlivých směsí se sečtou. Tak se získá řada výsledných součtů, z nichž každý představuje úmrtnost způsobenou směsí stejného složení. Zkušební dávka toxinu je množství obsažené v 0,5 ml té směsi, která způsobí úhyn poloviny celkového počtu myší, jimž se podala.

Stanovení účinnosti králičích sér.

Předběžná zkouška: Ve vhodné tekutině se rozpustí takové množství zkušebního toxinu, aby 2,0 ml obsahovaly desetinásobek zkušební dávky (roztok zkušebního toxinu). Připraví se směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupající objemů zkoušeného séra. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a nechají se 30 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Neuhyne-li žádná myš, obsahuje 0,5 ml směsi více než 1 m.j. beta-antitoxinu nebo 0,1 m.j. epsilon-antitoxinu. Uhynou-li všechny myši, obsahuje 0,5 ml směsi méně než 1 m.j. beta-antitoxinu nebo 0,1 m.j. epsilon-antitoxinu.

Konečná zkouška: Připraví se směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby 0,5 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra (v řadě se stoupající objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod stanovený v předběžné zkoušce). Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů roztoku referenčního přípravku. Všechny směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě a pro každou se použijí nejméně dvě myši, při čemž se dále postupuje tak, jak je popsáno v předběžné zkoušce.

Beta-antitoxin. Zkoušená směs, která obsahuje 1 m.j. v 0,5 ml, je ta směs, která usmrtí shodný nebo téměř shodný počet myší jako referenční směs, která obsahuje 1 m.j. v 0,5 ml.

Epsilon-antitoxin. Zkoušená směs, která obsahuje 0,1 m.j. v 0,5 ml, je ta směs, která usmrtí shodný nebo téměř shodný počet myší jako referenční směs, která obsahuje 0,1 m.j. v 0,5 ml.

Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných výsledků. Výsledky jsou platné pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) stanovení účinnosti jsou stanoveny takto:

- 85 % až 114 %, použila-li se dvě zvířata na dávku,

- 91,5 % až 109 %, použila-li se čtyři zvířata na dávku,

- 93 % až 108 %, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- typ nebo typy Clostridium perfringens, ze kterých je vakcína připravena,

- je-li přípravek toxoid nebo vakcína připravená z celé inaktivované kultury, nebo je-li to směs obou,

- že se před použitím přípravek roztřepe.

Vaccinum clostridii septici ad usum veterinarium ⟪MEDIA:img_001⟫

Vakcína proti Clostridium septicum pro veterinární použití

Připravuje se z tekuté kultury vhodného kmene mikroba Clostridium septicum. Celá kultura nebo její filtrát nebo směs obou se inaktivuje tak, aby se odstranila toxicita, ale imunogenita zůstala zachována.

K toxoidům a inaktivovaným kulturám se může přidat vhodné adjuvans.

Zkouška totožnosti

Když se přípravek vstříkne zdravým a vnímavým zvířatům, vyvolá tvorbu antitoxinu proti Cl. septicum.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě zdravá vnímavá zvířata jednoho z druhů, pro které je přípravek určen. Doporučeným způsobem se každému zvířeti vstříkne dvojnásobek nejvyšší dávky uvedené v označení. Zvířata se pozorují 7 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Zbytková toxicita. Pěti myším hmotnosti 17 g až 22 g se podkožně vstříkne po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Nejméně deseti zdravým králíkům starým tři až šest měsíců se podkožně vstříkne zkoušený přípravek v dávce, která nepřesahuje nejnižší první dávku uvedenou v označení. Za 21 až 28 dní se provede přeočkování dávkou, která nepřesahuje nejnižší druhou dávku uvedenou v označení. Za 10 až 14 dní po přeočkování se králíkům odebere krev a vytvoří se směsný vzorek sér. Účinnost směsného vzorku sér je nejméně 2,5 m.j. v mililitru.

Mezinárodní jednotka je specifická účinnost neutralizující toxin Cl. septici obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušeného imunníh o koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuj e Světová zdravotnická organizace.

Účinnost směsného vzorku sér králíků se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat před toxickým účinkem dávky toxinu Cl. septicum s dávkou referenčního přípravku antitoxinu Cl. septicum, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, nezbytnou k vytvoření stejné ochrany. K tomuto porovnání je zapotřebí vhodný přípravek toxinu Cl. septicum, který se použije jako zkušební toxin. Dávka zkušebního toxinu se stanoví proti referenčnímu přípravku, účinnost zkoušeného séra se stanoví porovnáním s referenčním přípravkem za použití zkušebního toxinu.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví ze sterilního filtrátu jednodenní až třídenní kultury Cl. septicum v tekuté živné půdě a vysuší se vhodnou metodou.

Toxin se vybírá podle stanovení dávky L+/5 a LD 50 pro myši. Doba pozorování je 72 h. Vhodný toxin obsahuje nejméně jednu dávku L+/5 a 1,0 mg a nejméně 10 LD 50 v jedné dávce L+/5.

Stanovení zkušební dávky toxinu. Ve vhodné tekutině se připraví roztok referenčního přípravku tak, aby v 1 ml obsahoval 1,0 m.j. Roztok zkušebního toxinu ve vhodné tekutině se připraví tak, aby v 1,0 ml obsahoval přesně známé množství, např. 4 mg. Připraví se směsi roztoků referenčního přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku referenčního přípravku (2 m.j.) a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a uchovávají se 60 min při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši hmotnosti 17 g až 22 g a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h.

Uhynou-li všechny myši, je množství toxinu, obsažené v 0,5 ml směsi vyšší než zkušební dávka. Neuhyne-li žádná myš, je množství toxinu obsažené v 0,5 ml směsi nižší než zkušební dávka.

Potom se připraví čerstvé směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku referenčního přípravku (2 m.j.) a jeden z řady stoupajících objemů roztoku zkušebního toxinu (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod). Směsi se nechají 60 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Zkouška se nejméně jedenkrát opakuje a výsledky u jednotlivých směsí se sečtou. Tak se získá řada výsledných součtů, z nichž každý představuje úmrtnost způsobenou směsí stejného složení. Zkušební dávka toxinu je množství obsažené v 0,5 ml té směsi, která způsobí úhyn poloviny celkového počtu myší, jimž se podala.

Stanovení účinnosti králičích sér.

Předběžná zkouška: Ve vhodné tekutině se rozpustí takové množství zkušebního toxinu, aby 2,0 ml obsahovaly desetinásobek zkušební dávky (roztok zkušebního toxinu). Připraví se směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra. Směsi se doplní vhodnou tekutinou na 5,0 ml a nechají se 60 min stát při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně 2 myši a každé se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml; pozorují se 72 h. Neuhyne-li žádná myš, obsahuje 0,5 ml směsi více než 0,2 m.j. Uhynou-li všechny myši, obsahuje 0,5 ml směsi méně než 0,2 m.j.

Konečná zkouška: Připraví se směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného séra tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra (v řadě se sousedící objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod stanovený v předběžné zkoušce). Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů roztoku referenčního přípravku. Všechny směsi se nechají 60 min stát při pokojové teplotě a pro každou se použijí nejméně dvě myši, přičemž se dále postupuje tak, jak je popsáno v předběžné zkoušce. Zkoušená směs, která obsahuje 0,2 m.j. v 0,5 ml, je ta směs, která usmrtí shodný nebo téměř shodný počet myší jako referenční směs, která obsahuje 0,2 m.j. v 0,5 ml. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných výsledků. Výsledky jsou platné pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) stanovení účinnosti jsou stanoveny takto:

- 85 % až 114 %, použila-li se dvě zvířata na dávku,

- 91,5 % až 109 %, použila-li se čtyři zvířata na dávku,

- 93 % až 108 %, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- je-li přípravek toxoid, nebo vakcína připravená z celé inaktivované kultury, nebo směs obou,

- že se před použitím přípravek roztřepe.

Vaccinum colibacillosis fetus a partu recentis inactivatum ad ruminantes ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti neonatální kolibacilóze přežvýkavců

Synonymum. Inaktivovaná očkovací látka proti neonatální kolibacilóze přežvýkavců

Je to přípravek z kultur jednoho nebo více vhodných kmenů Escherichia coli obsahujících jeden nebo více adhezinů nebo enterotoxinů. Podává se injekčně samicím k ochraně nově narozeného potomstva před enterální formou kolibacilózy.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Výrobní kmeny E. coli se pomnožují odděleně ve vhodné živné půdě. Buňky nebo toxiny se zpracují tak, aby byly neškodné, a pak se smíchají. Vakcína může obsahovat jedno nebo více adjuvancií.

Výběr složení vakcíny

Kmeny E. coli používané k výrobě vakcíny prokazatelně vyhovují exprimovanými antigeny a vakcína rovněž vyhovuje bezpečností a imunogenitou. Tyto vlastnosti se mohou prokázat následujícími zkouškami.

Exprese antigenů. Exprese antigenů, které podněcují ochranou imunitní odpověď, se ověří vhodnými imunochemickými metodami (2.7.1) na antigenu z každého vakcinačního kmene získaném za podmínek použitých při výrobě vakcíny.

Bezpečnost. Deseti březím samicím každého druhu, pro který je vakcína určena, se podá dvojitá dávka vakcíny. Po intervalu uvedeném v označení na obalu se podá jedna dávka. Zvířata se pozoruj í až do porodu. Nezjistí se žádné abnormální místní ani systémové reakce, ani se nezjistí vliv na březost a potomstvo.

Bezpečnost se dokazuje v terénních pokusech pro každý druh, pro který je vakcína určena, podáním určené dávky nejméně šedesáti zvířatům ze třech různých chovů a to způsobem a podle schématu uvedeným v označení na obalu. Nejméně třicet zvířat ze stejných chovů tvoří kontrolní skupinu. Zvířata se pozorují 14 dní po poslední dávce. Neprojeví se žádné abnormální místní ani celkové reakce, zejména nedojde ke zvýšení teploty o více než 1,5 °C po dva dny od podání každé dávky vakcíny.

Imunogenita. Vhodnost vakcíny z hlediska imunogenity se prokáže pro každý druh, pro který je určena. Může se to dokázat zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkouška účinnosti šarže

Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se neprovádí při rutinním zkoušení šarží vakcíny. S danou vakcínou se provede jednou nebo několikrát podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Kde se neprovede tato zkouška, použije se vhodná validovaná zkouška. Kritéria pro přijetí se stanoví ve vztahu k šarži, která dává vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Následující zkouška se může použít, je-li statisticky prokázána korelace se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

K dosažení platné zkoušky může být nezbytné provést zkoušku na několika skupinách zvířat, z nichž každá dostane odlišnou dávku. Pro každou dávku se zkouška provede takto. Nejméně pět králíků, morčat nebo myší prostých specifických protilátek proti deklarovaným antigenům se vakcinuje jedinou injekcí vhodné dávky. Další dva králíci, morčata nebo myši tvoří nevakcinovanou kontrolu. Jestliže vakcinační schéma v označení na obalu požaduje revakcinaci, může se použít doporučené vakcinační schéma, jestliže se prokázalo, že to tvoří zkušební systém vhodné citlivosti. V daném intervalu v rozmezí 14 až 21 dní po poslední injekci se všem zvířatům odebere krev a připraví se vzorky séra. K měření protilátkové odpovědi na každý ochranný antigen, který je uveden v označení na obalu, se použije vhodný validovaný test jako na enzymově imunosorbentové stanovení (ELISA). Hladina protilátek není signifikantně nižší než hladina u šarží, které dávaly vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti, a ani se nezjistí signifikantní vzestup titru protilátek u kontrol.

Kde nejsou dostupná seronegativní zvířata, mohou se použít séropozitivní. Při vývoji zkoušky se séropozitivními zvířaty je nutná zvláštní péče při validaci systému, aby bylo stanoveno, že zkouška je vhodně citlivá a aby se určila kritéria pro splnění, selhání a pro opakování zkoušky. Bude nezbytné vzít v úvahu rozmezí vhodných prevakcinačních titrů a určit ve vztahu k nim přijatelný nejmenší vzestup po vakcinaci.

Zkouška šarže na bakteriální endotoxiny

Zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14) se provádí u hotové šarže nebo, když vlastnosti adjuvancia brání provedení zkoušky, u várky antigenu nebo u směsi várek antigenu bezprostředně před přidáním adjuvancia. Vakcíny pro ovce prokazatelně obsahují nejvýše 5 . 10 4 m.j. endotoxinu v jedné dávce a vakcíny určené pro skot nebo kozy obsahují nejvýše 2,5 . 10 5 m.j. endotoxinu v jedné dávce, pokud nebylo prokázáno, že vyšší množství endotoxinu je pro jeden nebo druhý druh bezpečné.

Zkouška totožnosti

U zvířat prostých specifických protilátek proti antigenům uvedeným v označení na obalu podněcuje vakcína tvorbu protilátek proti těmto antigenům.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým zvířatům jednoho z těch druhů, pro které je vakcína určena, se každému vstříkne dvojnásobná dávka vakcíny způsobem uvedeným v označení na obalu. Za 14 dní se každému zvířeti podá jedna další dávka. Zvířata se pozorují dalších 14 dní. Neprojeví se žádná výrazná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Stanovení se provede s čelenžním kmenem, který představuje všechny typy antigenů, proti nimž má vakcína chránit. Jestliže není dosažitelný jeden kmen se všemi potřebnými antigeny, opakuj e se stanovení s různými čelenžními kmeny.

Použije se patnáct vnímavých zvířat jednoho z těch druhů, pro které je vakcína určena; tato zvířata jsou prosta specifických protilátek proti antigenům uvedeným v označení na obalu. Z nich se namátkově vybere deset, které se v březosti vakcinují dávkou a způsobem uvedeným v označení na obalu. Za 12 h po narození se z mláďat, která již dostala kolostrum, vezme deset zdravých od vakcinovaných zvířat a pět mláďat od nevakcinovaných kontrol. Mláďata se perorálně čelenžuj í patogenním kmenem E. coli, který není totožný s kmenem použitým při výrobě vakcíny. Pak se mláďata vrátí jejich matkám. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejméně čtyři z pěti mláďat od nevakcinovaných kontrol uhynou nebo mají vážné příznaky nemoci. Přípravek vyhovuje, jestliže nejvýše jedno mládě od vakcinovaných zvířat uhyne nebo má vážné příznaky nemoci a jestliže nejvýše tři další mají lehký průjem, který trvá nejdéle tři dny.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede antigen nebo antigeny obsažené ve vakcíně, které podněcuj í ochrannou imunitní odpověď.

Vaccinum colibacillosis fetus a partu recentis inactivatum ad suem ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti kolibacilóze novorozených selat

Synonymum. Inaktivovaná očkovací látka proti kolibacilóze novorozených selat

Je to přípravek z kultur jednoho nebo více vhodných kmenů Escherichia coli obsahujících jeden nebo více adhezinů či enterotoxinů. Podává se injekčně prasnicím a prasničkám k ochraně nově narozených selat před enterální kolibacilózou.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Výrobní kmeny E. coli se pomnožují odděleně ve vhodné živné půdě. Buňky nebo toxiny se zpracují tak, aby byly neškodné, a pak se smíchají. Vakcína může obsahovat jedno nebo více adjuvancií.

Výběr složení vakcíny

Kmeny E. coli používané k výrobě vakcíny prokazatelně odpovídají exprimovanými antigeny a vakcína prokazatelně odpovídá svou bezpečností a imunogenitou. Při prokázání bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Exprese antigenů. Exprese antigenů, které podněcují ochrannou imunitní odpověď, se ověří vhodnými imunochemickými metodami (2.7.1) na antigenu z každého vakcinačního kmene získaném za podmínek použitých při výrobě vakcíny.

Bezpečnost. Deseti březím prasnicím se podá dvojitá dávka vakcíny. Po intervalu uvedeném v označení na obalu se podá jedna dávka. Zvířata se pozorují až do porodu. Nezjistí se žádné abnormální místní ani systémové reakce, ani se nezjistí vliv na březost a potomstvo.

Bezpečnost se dokazuje v terénních pokusech podáním určené dávky nejméně šedesáti prasnicím ze třech různých chovů a to způsobem a podle schématu uvedeným v označení na obalu. Nejméně třicet prasnic ze stejných chovů tvoří kontrolní skupinu. Prasnice se pozorují 14 dní po poslední dávce. Neprojeví se žádné abnormální místní ani systémové reakce, zejména nedojde ke zvýšení teploty o více než 1,5 °C po dva dny od podání každé dávky vakcíny.

Imunogenita. Vhodnost vakcíny z hlediska imunogenity se může dokázat zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušky účinnosti šarže

Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnost se neprovádí při běžném zkoušení šarží. Provede se jednou nebo několikrát s určitou vakcínou podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Tam, kde se zkouška neprovede, použije se alternativní validovaná metoda.

Kritéria pro přijetí se stanoví ve vztahu k šarži, která dává vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnost. Následující zkouška se může použít, je-li statisticky prokázána korelace se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnost.

Použijí se selata stará nejméně tři týdny a prostá specifických protilátek proti antigenům uvedeným v označení. Každé z pěti selat se vakcinuje způsobem a podle schématu uvedeného v označení. Další dvě selata tvoří nevakcinovanou kontrolu. Jestliže povaha antigenů umožní dosáhnout reprodukovatelných výsledků, může se stanovení provést na laboratorních zvířatech. K dosažení platného stanovení může být nutné provést zkoušku za použití několika skupin zvířat, z nichž každá dostane jinou dávku. Pro každou dávku se provede následující zkouška. Nejméně pět králíků, morčat nebo myší se vakcinuje vhodnou dávkou v jedné injekci. Jako nevakcinované kontroly se použijí nejméně dva králíci, morčata nebo myši. Požaduje-li schéma uvedené v označení další injekci, má se provést doporučené schéma s laboratorními zvířaty, pokud bylo prokázáno, že to bude poskytovat vhodný zkušební systém. V daném intervalu v rozmezí 14 až 21 dní po poslední injekci se všem zvířatům odebere krev a připraví se vzorky séra. K měření protilátkové odpovědi na každý ochranný antigen, který je uveden v označení na obalu, se použije vhodný validovaný test, jako je enzymově imunosorbentové stanovení (ELISA). Hladina protilátek není signifikantně nižší než hladina u šarží, které dávaly vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnost a ani se nezjistí signifikantní vzestup titru protilátek u kontrol.

Kde nejsou dostupná séronegativní zvířata, mohou se použít séropozitivní. Při vývoji zkoušky se séropozitivními zvířaty je nutná zvláštní péče při validaci systému, aby bylo stanoveno, že zkouška je vhodně citlivá, a aby se určila kritéria pro splnění, selhání a pro opakování zkoušky. Bude nezbytné vzít v úvahu rozmezí vhodných prevakcinačních titrů a určit ve vztahu k nim přijatelný nejmenší vzestup po vakcinaci.

Zkouška šarže na bakteriální endotoxiny

Zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14) se provádí u hotové šarže nebo, když vlastnosti adjuvancia brání provedení zkoušky, u várky antigenu nebo u směsi várek antigenu bezprostředně před přidáním adjuvancia. Přípravek neobsahuje více než 1 . 10 6 m.j. endotoxinu v jedné dávce, pokud nebylo prokázáno, že vyšší množství endotoxinu je bezpečné.

Zkouška totožnosti

U zvířat prostých specifických protilátek proti antigenům uvedeným v označení na obalu podněcuje vakcína tvorbu protilátek proti těmto antigenům.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým selatům se každému vstříkne dvojnásobná dávka vakcíny předepsaným způsobem. Za 14 dní se každému zvířeti podá jedna další dávka. Zvířata se pozorují dalších 14 dní. Neprojeví se žádná výrazná místní ani celková reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Použije se osm vnímavých prasniček prostých specifických protilátek proti deklarovaným antigenům. Z nich se namátkově vyberou čtyři, které se v březosti vakcinují dávkou a způsobem uvedeným v označení. Do 12 h po vrhu mláďat, která již dostala kolostrum, se vezme patnáct selat od vakcinovaných zvířat a patnáct selat od nevakcinovaných, nejméně po třech z každého vrhu. Selata se perorálně čelenžují patogenním kmenem E. coli, který nesmí být totožný s kmenem použitým k výrobě vakcíny. Pak se selata vrátí jejich matkám. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejméně šest selat od kontrolních zvířat uhyne a jestliže nejvýše dvě selata od kontrolních zvířat nemají žádné příznaky nemoci. Vakcína vyhovuje, jestliže nejvýše dvě selata od vakcinovaných zvířat uhynou nebo mají příznaky těžkého onemocnění a nejvýše tři další mají nejdéle tři dny lehký průjem.

Pro některé vakcíny může být nezbytné, aby se čelenž provedla s kmenem, o němž byly uveřejněny údaje, že v experimentálních podmínkách nevyvolává vysokou mortalitu. Za těchto okolností lze zkoušku hodnotit jedině tehdy, jestliže nejméně devět selat od kontrolních zvířat má příznaky těžkého průjmu; vakcína vyhovuje, jestliže nejvýše čtyři selata od vakcinovaných zvířat mají nejdéle tři dny lehký průjem.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede antigen nebo antigeny obsažené ve vakcíně, které podněcuj í ochrannou imunitní odpověď.

Vaccinum diphtheriae adsorbatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Adsorbovaná vakcína proti záškrtu

Synonymum. Adsorbovaná očkovací látka proti záškrtu

Je to difterický toxoid adsorbovaný na minerální nosič. Toxoid se připravuje formaldehydovou inaktivací toxinu vytvořeného při růstu kultury mikroba Corynebacterium diphtheriae.

Výroba

Várka přečištěného toxoidu

Výchozí kultury, které vytvářejí difterický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuj e novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Corynebacterium diphtheriae známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Jakmile je to možné, oddělí se asepticky živná půda obsahující toxin od bakteriální masy. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v mililitru), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou pro přípravu várky přečištěného toxinu spojit. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly způsobit u člověka nežádoucí reakce. Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se smí použít pouze várka přečištěného toxoidu, který vyhovuje dále uvedeným požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost difterického toxinu. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně nejméně po 500 Lf přečištěného toxoidu v 1 ml. Jestliže se u některého ze zvířat během 42 dnů následujících po injekci projeví příznaky difterické toxemie nebo na ni zvíře uhyne, toxoid nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, toxoid nevyhovuje.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ± 3) °C a druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního difterického toxinu, jako je např. inokulace na buněčné kultury nebo intradermální injekce morčatům. Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající difterickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1500 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví adsorpcí vhodného množství přečištěného toxoidu na hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý; vzniklá směs je přibližně izotonická s krví. Je možno přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Některé z nich, zvláště fenolového typu, působí nepříznivě na antigenní účinnost, a nelze je tedy použít.

K výrobě šarže přípravku se použije pouze ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provede se zkouška popsaná ve stati Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

K použití může být uvolněna pouze šarže, která odpovídá všem požadavkům dále uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Pokud byly zkouška specifické neškodnosti, stanovení obsahu volného formaldehydu a protimikrobní konzervační látky a stanovení účinnosti provedeny s vyhovujícími výsledky u konečné várky vakcíny, mohou se u šarže vypustit.

Zkouška totožnosti

Zkoušky na čistotu

Specifická neškodnost. Pěti zdravým morčatům o hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, která by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně pětinásobek lidské dávky uvedené v označení. Jestliže se u některého ze zvířat během 42 dnů následujících po injekci projeví příznaky difterické toxemie nebo na ni zvíře uhyne, přípravek nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje.

Hliník. Pokud se jako nosič použije hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Vápník. Pokud se jako nosič použije fosforečnan vápenatý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Nejméně nejnižší prokazatelně účinné množství, nejvýše 115 % deklarovaného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Provede se jedno z předepsaných stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti záškrtu (2.7.6). Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 30 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce,

- je-li to vhodné, že vakcína je určena pro první očkování dětí a není nutně vhodná pro podpůrné dávky nebo pro podávání dospělým,

- název a množství nosiče,

- že vakcína se před použitím roztřepe,

- že vakcína nesmí zmrznout.

Vaccinum diphtheriae adulti et adulescentis adsorbatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Adsorbovaná vakcína proti záškrtu pro dospělé a dospívající

Je to difterický toxoid adsorbovaný na minerální nosič. Toxoid se připravuje formaldehydovou inaktivací toxinu vytvořeného při růstu kultury mikroba Corynebacterium diphtheriae. Oprávněné autoritě se doloží, že množství použitého difterického toxoidu nepůsobí nežádoucí účinky u jedinců věkových skupin, pro které je vakcína určena.

Výroba

Várka přečištěného toxoidu

Výchozí kultury, které vytvářejí difterický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem j ednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuje novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Corynebacterium diphtheriae známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Jakmile je to možné, oddělí se asepticky živná půda obsahující toxin od bakteriální masy. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v mililitru), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou pro přípravu várky přečištěného toxinu spojit. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly způsobit u člověka nežádoucí reakce. Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se smí použít pouze várka přečištěného toxoidu, který vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ± 3) °Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního difterického toxinu, jako je např. inokulace na buněčné kultury nebo intradermální injekce morčatům. Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající difterickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1500 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví adsorpcí vhodného množství přečištěného toxoidu na hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý; vzniklá směs má být přibližně izotonická s krví. Je možno přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Některé z nich, zvláště fenolového typu, působí nepříznivě na antigenní aktivitu, a nelze je tedy použít.

K výrobě šarže přípravku se použije pouze ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provede se zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

K použití může být uvolněna pouze šarže, která odpovídá všem požadavkům dále uvedeným v odstavcích Zkoušky totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Pokud byly zkouška specifické neškodnosti, stanovení obsahu volného formaldehydu a protimikrobní konzervační látky a stanovení účinnosti provedeny s vyhovujícími výsledky u konečné várky vakcíny, mohou se u šarže vypustit.

Zkouška totožnosti

Ve zkoušeném přípravku se rozpustí takové množství citronanu sodného R, aby výsledná koncentrace byla 100 g/l. Inkubuje se 16 h při 37 °C a pak se odstřeďuje, dokud se nezíská čirý supernatant. Tento supernatant reaguje s vhodným difterickým antitoxinem za vzniku precipitátu. Pokud vakcína adsorbovaná na hydroxid hlinitý nedává uspokojivý výsledek, provede se tato zkouška: 15 ml zkoušeného přípravku se odstředí, sediment se resuspenduje v 5 ml čerstvě připravené směsi objemových dílů roztoku edetanu disodného R (56 g/l) a roztoku hydrogenfosforečnanu sodného R (90 g/l) (1 + 49). Inkubuje se alespoň 6 h při 37 °C a potom se odstředí. Čirý supernatant reaguje s vhodným difterickým antitoxinem za vzniku precipitátu.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Pokud se jako nosič použije hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Vápník. Pokud se jako nosič použije fosforečnan vápenatý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Nejméně nejnižší prokazatelně účinné množství, nejvýše 115% deklarovaného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Provede se jedno z předepsaných stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti záškrtu (2.7.6). Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 2 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce,

- název a množství nosiče,

- že vakcína se před použitím roztřepe,

- že vakcína nesmí zmrznout.

Vaccinum diphtheriae et tetani adsorbatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Adsorbovaná vakcína proti záškrtu a tetanu

Synonymum. Adsorbovaná očkovací látka proti záškrtu a tetanu

Výroba

Várka přečištěného difterického toxoidu

Výchozí kultury, které vytvářejí difterický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuje novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Corynebacterium diphtheriae známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Jakmile je to možné, oddělí se asepticky živná půda obsahující toxin od bakteriální masy. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v mililitru), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou pro přípravu várky přečištěného toxinu spojit. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly způsobit u člověka nežádoucí reakce. Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost difterického toxinu. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně nejméně 500 Lf přečištěného toxoidu v 1 ml. Jestliže se u některého ze zvířat během 42 dnů následujících po injekci projeví příznaky difterické toxemie nebo na ni zvíře uhyne, toxoid nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, toxoid nevyhovuje.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3) °Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního difterického toxinu, jako je např. inokulace na buněčné kultury nebo intradermální injekce morčatům. Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající difterickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1500 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Várka přečištěného tetanického toxoidu

Výchozí pracovní kultury, které vytvářejí tetanický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuje novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Clostridium tetani známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné tekuté živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Asepticky se shromáždí živné půdy obsahující toxin. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v ml), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou spojit, aby se připravila várka přečištěného toxinu. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly u člověka způsobit nežádoucí reakce. Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost tetanického toxinu. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně nejméně 500 Lf přečištěného toxoidu v 1 ml. Jestliže se u některého ze zvířat během 21 dnů následujících po injekci projeví příznaky tetanu nebo na něj zvíře uhyne, toxoid nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, toxoid nevyhovuje.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3)°Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního tetanického toxinu, jako je např. vstříknutí myším nebo morčatům. Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající tetanickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1000 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví adsorpcí vhodných množství přečištěného difterického toxoidu a tetanického toxoidu na hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý; vzniklá směs je přibližně izotonická s krví. Je možno přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Některé z nich, zvláště fenolového typu, působí nepříznivě na antigenní aktivitu, a nelze je tedy použít.

K přípravě šarže se může použít pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provede se zkouška popsaná ve stati Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Zkoušky totožnosti

B. Čirý supernatant získaný ve zkoušce A reaguje s vhodným tetanickým antitoxinem za vzniku precipitátu.

Zkoušky na čistotu

Specifická neškodnost. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, která by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně pětinásobek lidské dávky uvedené v označení. Jestliže během 42 dnů po injekci kterékoli ze zvířat uhyne za příznaků difterické toxemie nebo tetanu nebo se u něj jejich příznaky projeví, přípravek nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje.

Hliník. Pokud se jako nosič použije hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Vápník. Pokud se jako nosič použije fosforečnan vápenatý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Difterická složka. Provede se jedno z předepsaných stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti záškrtu (2.7.6).

Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 30 m.j. v jedné lidské dávce.

Tetanická složka. Provede se jedno z předepsaných stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti tetanu (2.7.8). Pokud není uvedeno jinak, oprávněná autorita upřednostňuje pro vyhodnocení zkoušky letální metodu.

Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 40 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se dále uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce pro každou složku,

- je-li to vhodné, že vakcína je určena pro první očkování dětí a není nutně vhodná pro podpůrné dávky nebo pro podávání dospělým,

- název a množství nosiče,

- že vakcína se před použitím roztřepe,

- že vakcína nesmí zmrznout.

Vaccinum diphtheriae et tetani adulti et adulescentis adsorbatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Adsorbovaná vakcína proti záškrtu a tetanu pro dospělé a dospívající

Je to směs difterického a tetanického toxoidu adsorbovaná na minerální nosič. Toxoidy se připravují formaldehydovou inaktivací toxinů vytvořených při růstu kultur mikrobů Corynebacterium diphtheriae a Clostridium tetani. Oprávněné autoritě se doloží, že množství použitého difterického toxoidu nepůsobí nežádoucí účinky u jedinců těch věkových skupin, pro které je vakcína určena.

Výroba

Várka přečištěného difterického toxoidu

Výchozí kultury, které vytvářejí difterický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuje novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Corynebacterium diphtheriae známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Jakmile je to možné, oddělí se asepticky živná půda obsahující toxin od bakteriální masy. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v mililitru), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou pro přípravu várky přečištěného toxinu spojit. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly způsobit u člověka nežádoucí reakce.

Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost difterického toxinu. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně nejméně 500 Lf přečištěného toxoidu v 1 ml. Jestliže se u některého ze zvířat během 42 dnů následujících po injekci projeví příznaky difterické toxemie nebo na ni zvíře uhyne, toxoid nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, toxoid nevyhovuje.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3) °Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního difteríckého toxinu, jako je např. inokulace na buněčné kultury nebo intradermální injekce morčatům. Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající difterickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1500 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Várka přečištěného tetanického toxoidu

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3)°Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního tetanického toxinu, jako je např. vstříknutí myším nebo morčatům. Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající tetanickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1000 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakciny se připraví adsorpcí vhodných množství přečištěného difterického toxoidu a tetanického toxoidu na hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý; vzniklá směs je přibližně izotonická s krví. Je možno přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Některé z nich, zvláště fenolového typu, působí nepříznivě na antigenní aktivitu, a nelze je tedy použít.

K přípravě šarže se může použít pouze konečná várka vakciny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provede se zkouška popsaná ve stati Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakciny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů nádobek. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Zkoušky totožnosti

A. Ve zkoušeném přípravku se rozpustí takové množství citronanu sodného R, aby výsledná koncentrace byla 100 g/l. Inkubuje se 16 h při 37 °C a pak se odstřeďuje, dokud se nezíská čirý supernatant. Tento supernatant reaguje s vhodným difterickým antitoxinem za vzniku precipitátu. Pokud vakcína adsorbovaná na hydroxid hlinitý nedává uspokojivý výsledek, provede se tato zkouška: 15 ml zkoušeného přípravku se odstředí, sediment se resuspenduje v 5 ml čerstvě připravené směsi objemových dílů roztoku edetanu disodného R (56 g/l) a roztoku hydrogenfosforečnanu sodného R (90 g/l) (1 + 49). Inkubuje se nejméně 6 h při 37 °C a potom se odstředí. Čirý supernatant reaguje s vhodným difterickým antitoxinem za vzniku precipitátu.

B. Čirý supernatant získaný ve zkoušce A reaguje s vhodným tetanickým antitoxinem za vzniku precipitátu.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Pokud se jako nosič použije hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Vápník. Pokud se jako nosič použije fosforečnan vápenatý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Difterická složka. Provede se jedno z předepsaných stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti záškrtu (2.7.6).

Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 2 m.j. v jedné lidské dávce.

Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 20 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se dále uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce pro každou složku,

- název a množství nosiče,

- že vakcína se před použitím roztřepe,

- že vakcína nesmí zmrznout.

Vaccinum diphtheriae, tetani et pertussis adsorbatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Smíšená vakcína proti záškrtu, tetanu a dávivému kašli

Synonymum. Smíšená očkovací látka proti záškrtu, tetanu a dávivému kašli

Je to směs difterického a tetanického toxoidu adsorbovaná na minerální nosič a suspenze inaktivovaných mikrobů Bordetella pertussis. Toxoidy se připravují formaldehydovou inaktivací toxinů vytvořených při růstu kultur mikrobů Corynebacterium diphtheriae a Clostridium tetani.

Výroba

Várka přečištěného difterického toxoidu

Výchozí kultury, které vytvářejí difterický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuje novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Corynebacterium diphtheriae známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Jakmile je to možné, oddělí se asepticky živná půda obsahující toxin od bakteriální masy. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v mililitru), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou pro přípravu várky přečištěného toxinu spojit. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly způsobit u člověka nežádoucí reakce. Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost difterického toxinu. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně nejméně 500 Lf přečištěného toxoidu v 1 ml. Jestliže se u některého ze zvířat během 42 dnů následujících po injekci projeví příznaky difterické toxemie nebo na ni zvíře uhyne, toxoid nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, toxoid nevyhovuje.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3) °Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního difterického toxinu, jako je např. inokulace na buněčné kultury nebo intradermální injekce morčatům. Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající difterickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1500 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Várka přečištěného tetanického toxoidu

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3) °Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního tetanického toxinu, jako je např. vstříknutí myším nebo morčatům.

Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající tetanickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1500 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Suspenze inaktivovaných mikrobů Bordetella pertussis

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Použije se jeden nebo více kmenů mikroba B. pertussis známého původu a udržování. Kmeny, živná půda a kultivační metoda se volí tak, aby v hotovém přípravku byly zastoupeny aglutinogeny 1, 2 a 3. Každý kmen se pěstuje 24 h až 72 h v tekuté půdě nebo na pevné půdě; půda použitá při posledním kultivačním stupni neobsahuje krev nebo krevní deriváty. Lidská krev ani krevní deriváty z ní připravené se v živných půdách nepoužijí. Bakterie se sklidí, promytím se odstraní příměsi pocházející z živné půdy a bakterie se suspendují v roztoku chloridu sodného (9 g/l) nebo v jiném vhodném izotonickém roztoku. Denzita suspenze se stanoví nejpozději dva týdny po sklizení porovnáním s mezinárodním referenčním preparátem denzity a takto získaná hodnota se použije jako základ pro výpočet v následujících krocích při přípravě vakcíny. Hodnotu mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Jednotlivé sklizně se nepoužijí pro konečnou várku vakcíny, pokud nebylo prokázáno, že obsahují buňky B. pertussis se stejnými vlastnostmi, pokud jde o růst a aglutinogeny, jako původní kmen a že nejsou kontaminovány bakteriemi a houbami. Bakterie se usmrtí a detoxikují za kontrolovaných podmínek buď vhodnou chemickou látkou, nebo teplem, nebo kombinací těchto dvou metod. Nepřítomnost živých mikrobů B. pertussis se zkouší za použití vhodné živné půdy. Suspenze se uchovává po vhodnou dobu při (5 ± 3) °C, aby se snížila její toxicita.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví adsorpcí vhodného množství přečištěného difterického toxoidu a přečištěného tetanického toxoidu na hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý a přidáním vhodného množství suspenze inaktivovaných mikrobů B. pertussis; vzniklá směs je přibližně izotonická s krví. Koncentrace mikrobů B. pertussis v konečné várce vakcíny nepřesahuje koncentraci odpovídající denzitě 20 m.j. na jednu lidskou dávku. Pokud se použijí dva nebo více kmenů B. pertussis, je složení po sobě jdoucích šarží vycházejících z konečné várky vakcíny stejné, pokud jde o zastoupení každého kmene, vyjádřené v jednotkách denzity. K várce vakcíny je možno přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Některé z nich, zvláště fenolového typu, působí nepříznivě na antigenní aktivitu a nelze je tedy použít.

K výrobě šarže přípravku se použije pouze ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provedou se zkoušky popsané v odstavci Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Zkoušky totožnosti

B. Čirý supernatant získaný ve zkoušce A reaguje s vhodným tetanickým antitoxinem za vzniku precipitátu.

C. Totožnost pertussové složky se prokáže aglutinací bakterií v resuspendovaném sedimentu po odstředění (viz zkoušku totožnosti A; je možno použít i jiné vhodné metody oddělení bakterií od nosiče) specifickým sérem proti B. pertussis nebo zkouškou popsanou ve stati Stanovení účinnosti.

Zkoušky na čistotu

Specifická neškodnost.

Difterická a tetanická složka. Pěti zdravým morčatům o hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, která by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně pětinásobek lidské dávky uvedené v označení. Jestliže během 42 dnů po injekci kterékoli ze zvířat uhyne za příznaků difterické toxemie nebo tetanu nebo se u něj jejich příznaky projeví, přípravek nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje.

Pertussová složka. Nejméně deset zdravých myší o hmotnosti 14 g až 16 g se použije pro skupinu zkoušenou i kontrolní. Myši musí být stejného pohlaví nebo musí být obě pohlaví ve skupinách rovnoměrně zastoupena. Zvířata musí mít přístup k potravě a vodě po celou zkoušku a nejméně 2 h před jejím začátkem. Každé myši ze zkoušené skupiny se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml tak, aby dávka obsahovala množství vakcíny odpovídající nejméně polovině jedné lidské dávky. Každé myši z kontrolní skupiny se vstříkne 0,5 ml sterilního roztoku chloridu sodného R (9 g/l) obsahujícího, pokud možno, stejné množství protimikrobní konzervační látky, které bylo podáno ve vakcíně. Obě skupiny se zváží těsně před začátkem zkoušky a pak 72 h a 7 dní po podání. Vakcína vyhovuje požadavkům zkoušky jestliže: a) po 72 h není celková hmotnost skupiny očkovaných myší menší než před zkouškou, b) po sedmi dnech není průměrný přírůstek hmotnosti očkovaných myší menší než 60 % průměrného přírůstku hmotnosti myší kontrolních a c) během zkoušky uhyne nejvýše 5 % očkovaných myší.

Hliník. Pokud se jako nosič použije hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Vápník. Pokud se jako nosič použije fosforečnan vápenatý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Difterická složka. Provede se jedno s předepsaných stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti záškrtu (2.7.6).

Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 30 m.j. v jedné lidské dávce.

Provádí-li se zkouška na morčatech, je dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti nejméně 40 m.j. v jedné lidské dávce, u zkoušky na myších nejméně 60 m.j. v jedné lidské dávce.

Pertussová složka. Provede se Stanovení účinnosti vakcíny proti dávivému kašli (2.7.7).

Stanovená účinnost je nejméně 4 m.j. v jedné lidské dávce a dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 2 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce pro každou složku,

- je-li to vhodné, že vakcína je určena pro první očkování dětí a není nutně vhodná pro podpůrné dávky nebo pro podávání dospělým,

- název a množství nosiče,

- že vakcína se před použitím roztřepe,

- že vakcína nesmí zmrznout.

Vaccinum encephalomyelitidis infectivae aviariae vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti infekční ptačí encefalomyelitidě

Je to přípravek z imunogenního kmene viru infekční encefalomyelitidy ptáků.

Výroba

Kmen viru se pomnožuje ve žloutkovém vaku kuřecích embryí z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Jsou-li buněčné kultury ptačího původu, získávají se z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2). Suspenze víru se sklidí a smíchá s vhodnou stabilizující tekutinou. Vakcína může být lyofilizovaná nebo tekutá.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu vakcíny se může použít pouze takový virový kmen, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska imunogenity a s omezenou patogenitou.

Při prokazování bezpečnosti se může použít následující zkouška (5.2.6).

Omezená patogenita. Vstříkne-li se jednodenním kuřatům z chovu prostého specifikovaných patogenů intracerebrálně dávka 100 EID 50 , nezpůsobí žádné příznaky infekční ptačí encefalomyelitidy dříve než devátý den po injekci.

Zkoušení šarže

Pokud byly zkoušky na viry ptačí leukózy a na cizí viry na buněčných kulturách a na kuřecích embryích provedeny s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, mohou být tyto zkoušky při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěny, jestliže k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s uspokojivým výsledkem na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěna, jestliže k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Vakcína, je-li třeba rekonstituovaná, se vstříkne do žloutkového vaku vnímavých pětidenních až šestidenních kuřecích embryí. Vylíhlá kuřata se pozorují 10 dní. Vykazují nervové příznaky charakteristické pro infekční ptačí encefalomyelitidu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset kuřat starých 3 týdny z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Každému z kuřat se orálně podá deset dávek vakcíny rekonstituované tak, aby byla získána vhodná koncentrace pro zkoušku. Kuřata se pozorují 21 dní. Jestliže v době pozorování uhynou více než dvě kuřata z příčin, které nelze přisoudit vakcíně, zkouška se opakuje. Vakcína vyhovuje, jestliže se u žádného z kuřat nevyvinou příznaky nebo neuhyne z příčin, které lze přisoudit vakcíně.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Vakcína, je-li třeba rozpuštěná, vyhovuje po neutralizaci zkoušce na leukózní viry. Jestliže není možné neutralizovat vakcinační virus, provede se jiná vhodná zkouška.

Důkaz cizích virů zkouškou na buněčných kulturách (2.6.5). Zkoušený přípravek, co nejvíce neutralizovaný, vyhovuje zkoušce na cizí viry provedené na buněčných kulturách.

Důkaz cizích virů zkouškou na kuřecích embryích (2.6.3). Zkoušený přípravek, co nejvíce neutralizovaný, vyhovuje zkoušce na cizí viry provedené na kuřecích embryích.

Důkaz cizích agens zkouškou na kuřatech (2.6.6). Vakcína, je-li třeba rozpuštěná, vyhovuje zkoušce na cizí agens. V této zkoušce se použijí kuřata stará 3 týdny.

Bakterie a houby. Provede se kvantitativní zkouška na bakterie a houby. Vakcína neobsahuje více než jeden saprofytický mikroorganismus na dávku a je prosta patogenních mikroorganismů. Každá tekutina dodávaná s vakcínou vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Přípravek se titruje v buněčných kulturách nebo inokulací do žloutkového vaku kuřecích embryí starých 5 až 6 dnů. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá nejnižšímu deklarovanému titru.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá kuřata z jednoho chovu prostého specifikovaných patogenů, stará tři týdny (5.2.2). Jestliže se doporučuje očkování celého hejna, podá se každému z nejméně dvaceti kuřat pro každý z uvedených způsobů podání takový objem rozpuštěné vakcíny, který obsahuje množství viru, jež odpovídá nejnižšímu deklarovanému titru. Jestliže se doporučuje vakcinace jen části hejna, podá se každému z pěti kuřat pro každý z udávaných způsobů podání objem vakcíny obsahující množství viru, jež odpovídá nejnižšímu deklarovanému titru a jako kontaktní kontrola se zařadí nejméně padesát kuřat. V obou případech se pro kontrolu použije dvacet kuřat. Za 28 dní se intracerebrálně čelenžují všechna kuřata očkovaných skupin i kontrolní skupiny a nejméně dvacet náhodně vybraných kuřat ze skupiny kontaktních kontrol vhodným množstvím virulentního viru ptačí encefalomyelitidy. Kuřata se pozorují 21 dní. Přípravek vyhovuje, jestliže na konci období pozorování nejméně 80 % kuřat očkovaných přímo nebo kontaktem přežívá a nejeví příznaky onemocnění a nejméně 70 % kontrolních kuřat uhyne nebo vykazuje příznaky onemocnění.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- stáří zvířat, ve kterém mají být očkována,

- že tekutá vakcína se má použít bezprostředně po vyjmutí z chladničky.

Vaccinum erysipelatis suillae inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti července prasat

Synonymum. Inaktivovaná očkovací látka proti července prasat

Je to suspenze jednoho nebo více vhodných inaktivovaných kmenů Erysipelothrix rhusiopathiae (E. insidiosa).

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Kmeny E. rhusiopathiae, jejichž imunogenita byla zkontrolována na prasatech, se pomnoží na vhodných živných půdách. Po vhodné době kultivace se bakterie zcela inaktivují fyzikálními nebo chemickými prostředky nebo jejich kombinací; může se přidat adjuvans.

Zkouška totožnosti

Přípravek chrání vnímavá zvířata proti infekci vyvolané E. rhusiopathiae.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost.

A. Dvěma zdravým a vnímavým prasatům ve věku 3 až 4 měsíce se vstříkne způsobem uvedeným v označení po dvojnásobku dávky zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují nejméně 10 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

B. Deseti zdravým myším hmotnosti 17 g až 20 g se podkožně vstříkne po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují nejméně 10 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší proti smrtící dávce virulentní kultury E. rhusiopathiae s dávkou referenčního přípravku potřebnou k zajištění stejné ochrany. Biologické stanovení vyžaduje použití referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách a vhodné kultury E. rhusiopathiae, určené k přípravě čelenžní dávky. Mezinárodní jednotka je specifická účinnost obsažená v určitém množství mezinárodního standardu, který pozůstává z definovaného množství lyofilizované vakcíny proti července prasat. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Ke zkoušce se použijí zdravé bílé myši z jednotného chovu a hmotnosti 17 g až 20 g. Rozdělí se nejméně do šesti skupin po šestnácti zvířatech. Nejméně třem skupinám myší se podá referenční přípravek a nejméně třem skupinám zkoušený přípravek. Skupina deseti myší slouží jako kontrol a čelenžního kmene.

K čelenži se použije dostatečné množství virulentní kultury v růstové fázi vhodného kmene E. rhusiopathiae nebo takové ředění, aby se získala dávka, která usmrtí myši ve lhůtě dvou až pěti dní.

Pomocí roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se připraví nejméně tři ředění referenčního přípravku a nejméně tři ředění zkoušeného přípravku tak, aby v každé skupině byla dávka chránící asi 50 % myší co možná nejblíže střední hodnotě v řadě. Je vhodné např. použít dávky obsahující v 0,5 ml 0,2 m.j., 1,0 m.j. a 5,0 m.j. jak pro referenční, tak i pro zkoušený přípravek. Každé myši se podkožně vstříkne příslušné ředění a za 21 dní se všechny myši, včetně myší z kontrolní skupiny, intraperitoneálně čelenžují. Myši se pozorují 8 dní a zaznamenávají se počty uhynulých. Účinnost zkoušeného přípravku ve srovnání s referenčním přípravkem se vypočítá obvyklými statistickými metodami.

Přípravek obsahuje stanovení účinnosti, jestliže dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) zjištěné účinnosti není nižší než 50 m.j. v dávce pro prase.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení obalu se uvedou sérologické typy, proti nimž je přípravek účinný, pokud to požaduje oprávněná autorita.

Vaccinum febris flavae vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti žluté zimnici

Je to lyofilizovaný přípravek kmene 17D viru žluté zimnice (Flavivirus hominis), pomnoženého v kuřecích embryích. Vakcína se rozpustí bezprostředně před použitím předepsaným způsobem na čirou tekutinu.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou živou vakcínu proti žluté zimnici s přijatelnou imunogenitou a bezpečností pro člověka. Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že bude-li přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9) s následující úpravou zkoušky na morčatech: každému morčeti se vstříkne deset lidských dávek a pozorují se 21 dní.

Substrát pro kultivaci viru

Virus pro přípravu matečného a pracovního inokula a všech šarží vakcíny se pomnožuje v tkáních kuřecích embryí z chovu kuřat prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Inokula

Kmen 17D je určen podle původních záznamů, které obsahují informaci o původu kmene a následné manipulaci s ním. Inokula viru se připravují ve velkých množstvích a uchovávají se při teplotě pod -60 °C. Matečné a pracovní inokulum neobsahují žádnou lidskou bílkovinu ani přidané sérum.

Není-li jinak vysvětleno a schváleno, virus v konečné vakcíně je na úrovni 204. až 239. pasáže z původně izolovaného kmene 17D. Pracovní inokulum je pouze jedinou pasáží z matečného inokula. Pracovní inokulum se použije bez zprostředkující pasáže jako inokulum pro infikování tkání použitých k výrobě šarže vakcíny, aby bylo zajištěno, že vakcína byla vyrobena pouze jedinou pasáží z matečného inokula, které vyhovělo všem zkouškám na bezpečnost.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k pomnožení viru.

Zkouška totožnosti. V matečném a pracovním inokulu se virus žluté zimnice prokáže neutralizací sérem v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Cizí agens (2.6.16). Každé pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám:

Bakterie a houby - sterilita

Mykoplazmata

Mykobakterie

Ptačí viry

Zkouška na dospělých myších (pouze intraperitoneální inokulace)

Zkouška na morčatech

Zkouška na opicích. Každé matečné a pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám na opicích na viremii (viscerotropismus), imunogenitu a neurotropismus.

Používají se opice druhu Macaca citlivé na virus žluté zimnice, které v době podání virové kultury nejsou prokazatelně imunní vůči žluté zimnici, jsou zdravé a nebyly dříve intracerebrálně nebo intraspinálně očkovány. Mimo to nebyly očkovány jinými způsoby neurotropními viry nebo antigeny příbuznými viru žluté zimnice. Pro každou zkoušku se použije nejméně deset opic.

Použije se zkušební dávka 0,25 ml obsahující množství odpovídající nejméně 5000 myších LD 50 a nejvýše 50 000 myších LD 50 , stanovená titrací infekčního viru a za použití stanoveného vztahu mezi koncentrací viru a myší LD 50 (viz Stanovení účinnosti). Zkušební dávka se pod anestezií vstříkne každé opici do frontálního laloku a opice se pozorují nejméně 30 dní.

Viremie (viscerotropismus). Viscerotropismus je určen množstvím viru obsaženého v séru. Druhý, čtvrtý a šestý den po inokulaci se každé zkoušené opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Z každého séra se připraví ředění 1 : 10,1 :100 a 1 : 1000 a každé ředění se naočkuje do skupiny nejméně šesti nádob s buněčnou kulturou používanou ke stanovení virové koncentrace. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže žádné sérum neobsahuje více než ekvivalent 500 myších LD 50 v 0,03 ml a nejvýše jedno sérum obsahuje více než ekvivalent 100 myších LD 50 v 0,03 ml.

Imunogenita. Za 30 dní od podání zkušební dávky se každé opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže se nejméně 90 % zkoušených opic ukáže jako imunní, což se stanoví vyšetřením jejich séra v dále popsané zkoušce na neutralizaci viru žluté zimnice.

Ukázalo se, že malé ředění séra (např. 1:10) může obsahovat nespecifické inhibitory, které ovlivňují tuto zkoušku; takové sérum se upraví, aby se inhibitory odstranily. Ředění séra nejméně 1 : 10,1 : 40 a 1 : 160 od každé opice se smíchají se stejným objemem kultury vakcinačního viru 17D na ředění, které poskytne nejvhodnější počet plaků při použité titrační metodě. Směsi séra s virem se 1 h inkubují ve vodní lázni při 37 °C a pak se ochladí ve vodě s ledem; po 0,2 ml směsi séra s virem se dá na čtyři misky s buněčnou kulturou a postupuje se jako při stanovení koncentrace viru. Podobně se naočkuje deset misek stejným množstvím virové kultury smíchané se stejným objemem zředěného 1:10 séra, o němž se ví, že neobsahuje žádné neutralizující protilátky proti viru žluté zimnice. Na konci pozorovací doby se porovná průměrný počet plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a neimunní sérum s průměrným počtem plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a jednotlivá ředění každého opičího séra. Nejvýše 10 % zkoušených opic má sérum, které při ředění 1:10 nestačí snížit počet plaků o 50 %.

Neurotropismus. Neurotropismus (jak se uvádí při výskytu klinicky projevené encefalitidy a při stupni mortality) se stanoví následovně. Opice se denně vyšetřují personálem dobře seznámeným s klinickými příznaky encefalitidy u primátů (je-li třeba, opice se vyjmou z klecí, aby se zjistily známky motorické slabosti nebo křečí). U nejvýše 10 % zkoušených opic se rozvinou vážné příznaky encefalitidy (takové jako neúplná paralýza, nekoordinované třesy, letargie, neschopnost se spontánně postavit, motorická slabost nebo křeče) s frekvencí větší než příznaky vyvolané laboratorní referenční vakcínou, která má přijatelné vlastnosti u člověka a opic. Ani začátek a trvání febrilních reakcí, ani podstata příznaků a patologických nálezů nejsou takové, aby indikovaly změnu ve vlastnostech viru.

Pomnožování viru a sklizeň

Všechny práce s kuřecími embryi se provádějí v aseptických podmínkách v prostoru, kde se ve stejnou dobu nepracuje s jiným infekčním agens, ani s jinými buňkami. Dvě procenta, ale nejméně dvacet embryí a nejvýše padesát embryí se odloží stranou jako neinfikovaná kontrola embryí. Po inokulaci a inkubaci v kontrolované teplotě se sklízí jen živá a typická embrya. Stáří embrya v době sklizně viru se odhadne z původního vložení vajec do inkubátoru a mělo by být nejvýše 12 dní. Po homogenizaci a vyčeření odstředěním se výtažek z embryonální dřeně zkouší, jak je popsáno dále, a do dalšího zpracování se uchovává při -70 °C nebo nižší teplotě. Virové sklizně, které vyhoví zkouškám, se mohou smíchat. K virové suspenzi se v žádném stupni v průběhu výroby nepřidává žádná lidská bílkovina. Pokud se přidávají stabilizátory, pak prokazatelně nemají na člověka žádné antigenní ani senzibilizující působení.

Pouze jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Virová sklizeň obsahuje virus, který se dokáže sérovou neutralizací v buněčné kultuře při použití specifických protilátek jako virus žluté zimnice.

Cizí agens (2.6.16). Výtažek z embryonální dřeně, který tvoří jednotlivou sklizeň, vyhovuje následujícím zkouškám:

Bakterie a houby - sterilita

Mykoplazmata

Kontrolní vejce

Koncentrace viru. Aby se mohlo vypočítat ředění pro konečnou várku vakcíny, zkouší se každá sklizeň na koncentraci viru způsobem popsaným v odstavci Stanovení obsahu.

Konečná várka vakcíny

Sklizně viru, které vyhovují shora předepsaným zkouškám, se spojí a znovu čeří. Provede se stanovení bílkovinného dusíku. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se vhodně zředí.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Obsah bílkovinného dusíku. Obsah bílkovinného dusíku před přidáním stabilizátoru je nejvýše 0,25 mg v lidské dávce.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů a lyofilizuje se na obsah vlhkosti, která je prokazatelně vhodná pro stabilitu vakcíny. Potom se obaly uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a vniknutí vlhkosti.

Pouze šarže, která vyhovuje z hlediska tepelné stability a všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu se může uvolnit k použití. Pokud byla zkouška na ovalbumin provedena s uspokojivými výsledky na konečné várce vakcíny, může být u šarže vypuštěna.

Tepelná stabilita. Vzorky šarže lyofilizované vakcíny se inkubují v suchém stavu 14 dní při 37 °C. V inkubované i neinkubované vakcíně se souběžně stanoví koncentrace viru, jak je uvedeno v odstavci Stanovení obsahu. Rozdíl v koncentraci viru mezi inkubovanou a neinkubovanou vakcínou nepřesáhne 1,0 log 10 a koncentrace viru v lidské dávce inkubované vakcíny je nejméně počet jednotek tvořících plaky (PFU), odpovídající 1 . 10 3 myších LD 50

Zkouška totožnosti

Když se vakcína rekonstituuje podle návodu a smíchá se specifickými protilátkami proti viru žluté zimnice, dojde k signifikantnímu snížení její schopnosti infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Ovalbumin. Nejvýše 5 μg ovalbuminu v lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 5 m.j. bakteriálního endotoxinu v lidské dávce.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení obsahu

Infekční virus se titruje v buněčných kulturách. K validaci každého stanovení se použije vhodný virový referenční přípravek.

Koncentrace viru je nejméně ekvivalent v PFU 1 . 10 3 myších LD 50 v lidské dávce. Vztah mezi myší LD 50 a PFU si stanoví každá laboratoř a schválí jej oprávněná autorita.

Ke stanovení myší LD 50 se může použít dále uvedená metoda nebo jiný vhodný postup.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- kmen viru použitý v přípravku,

- že je vakcína připravena z kuřecích embryí,

- minimální koncentrace viru,

- že se má vyhnout styku s dezinfekčními prostředky,

- časový úsek, v němž se má vakcína použít po rekonstituci.

Navržená metoda ke stanovení myší LD 50

Myší LD 50 . Je to statisticky vypočítané množství virové suspenze, u něhož se očekává vyvolání fatální specifické encefalitidy u 50 % myší vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů starých, po intracerebrální inokulaci.

Připraví se vhodné sériové ředění rekonstituované vakcíny v rozpouštědle pro virus žluté zimnice, jako je např. roztok bovinního albuminu R (7,5 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným o pH 7,4 nebo jiné rozpouštědlo, které prokazatelně odpovídá udržením infekčnosti viru.

Myším vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů starým, se intracerebrálně vstříkne při anestezii 0,03 ml ředění vakcíny. Pro každé ředění se použije skupina o nejméně šesti myších; série ředění se zvolí tak, aby zasahovala od 0 % do 100 % myší mortality. Myši se naočkují ihned po přípravě ředění a pozorují se 21 dní. Všechny úhyny se zaznamenávají. Do výpočtu se zahrnují jenom přežívající myši a úhyny způsobené typickou infekcí žlutou zimnicí. Myši paralyzované dvacátý první den pozorování se počítají jako přežívající.

Vaccinum febris typhoidis ⟪MEDIA:img_001⟫

Vakcína proti tyfu

Je to sterilní suspenze inaktivovaných mikrobů Salmonella typhi obsahující nejméně 5 . 10 8 a nejvýše 1 . 10 9 bakterií (S. typhi) v lidské dávce. Lidská dávka nepřesahuje 1 ml.

Výroba

Připravuje se systémem jednotné inokulace z vhodného kmene S. typhi, jako např. Ty 2 4 ). Hotový přípravek představuje nejvýše tři subkultury kmene, u kterého byly provedeny laboratorní a klinické zkoušky prokazující jeho vhodnost. Bakterie se inaktivují acetonem, formaldehydem, fenolem nebo teplem, případně kombinací posledních dvou metod.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že výrobek, bude-li zkoušen, vyhoví takto upravené zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9): vstříkne se 0,5 ml vakcíny každé myši a 1,0 ml každému morčeti.

Zkouška totožnosti

Totožnost se prokazuje specifickou aglutinací.

Zkoušky na čistotu

Fenol (2.5.15). Nejvýše 5 g/l, pokud byl použit při výrobě přípravku.

Antigenní schopnost. Je-li vakcína podána vnímavým laboratorním zvířatům, vyvolá vznik anti-O, anti-H a v menší míře i anti-Vi aglutininů.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- metoda použitá k inaktivaci bakterií,

- počet bakterií v lidské dávce.

Vaccinum febris typhoidis cryodessicatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Lyofilizovaná vakcína proti tyfu

Je to lyofilizovaný přípravek inaktivovaných mikrobů Salmonella typhi. Rekonstituuje se předepsaným způsobem tak, aby vznikla stejnorodá suspenze obsahující nejméně 5 . 10 8 a nejvýše 1 . 10 9 bakterií (S. typhi) v lidské dávce. Lidská dávka nepřesahuje 1,0 ml rekonstituované vakcíny.

Výroba

Připravuje se systémem jednotné inokulace z vhodného kmene S. typhi, jako např. Ty 2 5 ). Hotový přípravek představuje nejvýše tři subkultury kmene, u kterého byly provedeny laboratorní a klinické zkoušky prokazující jeho vhodnost. Bakterie se inaktivují acetonem nebo formaldehydem nebo teplem; fenol se v přípravku nepoužívá. Plní se do sterilních obalů a lyofilizuje se do dosažení obsahu vlhkosti vhodného pro stabilitu vakcíny. Potom se obaly uzavřou tak, aby se vyloučila kontaminace.

Zkouška totožnosti

Totožnost přípravku rekonstituovaného podle návodu se prokazuje specifickou aglutinací.

Zkoušky na čistotu

Rekonstituovaný přípravek vyhovuje těmto zkouškám:

Antigenní schopnost. Je-li vakcína podána vnímavým laboratorním zvířatům, vyvolá vznik anti-O, anti-H a v menší míře i anti-Vi aglutininů.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- metoda použitá k inaktivaci bakterií,

- počet bakterií v jedné lidské dávce,

- že se vakcína použije do 8 h po rekonstituci.

Vaccinum febris typhoidis polysaccharidicum ⟪MEDIA:img_001⟫

Polysacharidová vakcína proti tyfu

Je to přípravek z purifikovaného Vi kapsulárního polysacharidu Salmonella typhi kmene Ty2 nebo jiného vhodného kmene, který má schopnost vytvářet Vi polysacharid.

Kapsulární Vi polysacharid sestává z částečně 3-O-acetylovaných opakujících se jednotek 2-acetylamino-2-deoxy-D-galaktopyranuronové kyseliny s -(1→4) řetězci.

Výroba

Výroba Vi polysacharidu je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stejnorodé tyfové polysacharidové vakcíny přiměřené svojí imunogenitou a bezpečností pro člověka.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví ve zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9).

Bakteriální inokula

Kmen S. typhi použitý jako matečné inokulum je určen podle průvodních záznamů, které zahrnují informace o jeho původu a biochemické a sérologické charakteristiky. Kultury pracovního inokula vykazují tytéž charakteristiky jako kmen, který byl použit k přípravě matečného inokula.

Pouze kmen, který má následující charakteristiky, se může použít pro přípravu vakcíny: a) barvené nátěry z kultury jsou typické pro enterobakterie; b) kultury zužitkovávají glukosu bez tvorby plynu; c) kolonie na agam jsou oxidasa-negativní; d) suspenze z kultur se specificky aglutinují s vhodným Vi antisérem nebo kolonie na agarové plotně obsahující vhodné Vi antisérum tvoří prstence.

Kultivace a sklizeň

Pracovní inokulum se kultivuje na pevné půdě, která může obsahovat substance krevních skupin, nebo v tekuté půdě; získané inokulum se přenese do tekuté živné půdy, která se použije k naočkování konečné živné půdy.

Použitá tekutá půda a konečná živná půda jsou semisyntetické, prosté látek, které se srážejí cetrimoniumbromidem a neobsahují krevní skupinové substance ani vysokomolekulární polysacharidy, pokud není prokázáno jejich odstranění purifikačním procesem.

Bakteriální čistota kultury se ověří mikroskopickým vyšetřením nátěru obarveného podle Grama a vyočkováním na vhodné živné půdy; několik polí se pozoruje při velkém zvětšení tak, aby se vyšetřilo nejméně 10 000 organismů. Kultura se pak na začátku stacionární fáze inaktivuje přidáním formaldehydu. Bakteriální buňky se odstraní odstředěním; polysacharid se z média precipituj e přidáním hexadecyltrimethylamoniumbromidu (cetrimoniumbromid). Precipitát se sklidí a může se před purifikací uchovávat při -20 °C.

Purifikovaný Vi polysacharid

Po rozštěpení polysacharid/cetrimoniumbromidového komplexu se polysacharid purifikuje za použití vhodných postupů k odstranění zbylých nukleových kyselin, bílkovin a lipopolysacharidů. Polysacharidy se srážejí jako vápenatá sůl v přítomnosti ethanolu a suší se při 2 °C až 8 °C; získaný prášek tvoří Vi polysacharid. Ztráta sušením se stanoví termogravimetricky (2.2.34) a získaná hodnota se použije k přepočtu výsledků dále uvedených chemických zkoušek na vysušenou látku.

Pouze purifikovaný Vi polysacharid, který vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Bílkovina (2.5.16). Nejvýše 10 mg v 1 g polysacharidu, počítáno na vysušenou látku.

Nukleové kyseliny (2.5.17). Nejvýše 20 mg v 1 g polysacharidu, počítáno na vysušenou látku.

O-Acetyl skupiny (2.5.19). Nejméně 2 mmol v 1 g polysacharidu, počítáno na vysušenou látku.

Molekulová velikost. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30) s použitím agarosy síťované pro chromatografii R. Použije se kolona délky 0,9 m a vnitřního průměru 16 mm, jejíž rovnováha byla ustavena rozpouštědlem s iontovou silou 0,2 mol/kg a hodnotou pH 7,0 až 7,5. Na kolonu se nanese asi 5 mg polysacharidu v objemu 1 ml a eluuje se asi 20 ml/h. Odebírají se frakce asi po 2,5 ml. Stanoví se bod odpovídající KD = 0,25 a udělají se dvě směsi sestávající z frakcí eluovaných před a po tomto bodě. Stanoví se O-acetyl skupiny v těchto dvou směsích (2.5.19). Ve směsi obsahující frakce eluované před bodem KD = 0,25 je nalezeno nejméně 50 % polysacharidu.

Zkouška totožnosti. Provede se zkouška totožnosti za použití vhodné imunochemické metody (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 150 m.j. endotoxinu v mikrogramu polysacharidu.

Konečná várka vakcíny

Jedna nebo více šarží purifikovaného Vi polysacharidu se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, které může obsahovat protimikrobní konzervační látku tak, aby objem odpovídající jedné dávce obsahoval 25 μg polysacharidu a roztok byl izotonický s krví (od 250 mosm/kg do 350 mosm/kg).

Pouze konečná várka vakciny, která vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro výrobu šarže.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakciny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu, na každou půdu se použije 10 ml.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou fyzikálně-chemickou metodou. Zjistí se 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Šarže

Konečná várka vakciny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů, které se potom uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům předepsaným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu může být uvolněna k použití. Pokud byly zkoušky na volný formaldehyd a protimikrobní konzervační látky provedeny v konečné várce vakciny, mohou se u šarže vypustit.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá tekutina, prostá viditelných částic.

Zkouška totožnosti

Provede se zkouška totožnosti použitím vhodné imunochemické metody (2.7.1).

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,5 až 7,5.

O-Acetyl skupiny. 0,085 (± 25 %) μmol v dávce (25 μg polysacharidu).

Zkoušený roztok. Do každé ze tří zkumavek se dá po 3 ml vakciny (dva reakční roztoky a jeden korekční roztok).

Porovnávací roztoky. 0,150 g acetylcholiniumchloridu R se rozpustí v 10 ml vody R (základní roztok obsahující 15 g/l acetylcholiniumchloridu). Bezprostředně před použitím se 0,5 ml základního roztoku zředí vodou R na 50 ml (pracovní ředění obsahující 150 μg /ml acetylcholinium chloridu). Do deseti zkumavek se ve dvojicích (reakční a korekční roztok) rozplní 0,1 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml pracovního ředění. Slepá zkouška se připraví ze 3 ml vody R.

Objem v každé zkumavce se doplní vodou R na 3 ml. Přidá se 0,5 ml směsi objemových dílů vody R, kyseliny chlorovodíkové zředěné R (1 +2) do každé korekční zkumavky a ke slepé zkoušce. Do každé zkumavky se se přidá 1,0 ml hydroxylamoniumchloridu alkalického RS. Reakce se nechá probíhat přesně 2 min a do každé z reakčních zkumavek se přidá 0,5 ml směsi objemových dílů vody R a kyseliny chlorovodíkové zředěné R (1 + 2). Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku chloridu železitého R (200 g/l) v kyselině chlorovodíkové 2 mol/l RS, zkumavky se zazátkují a silně se protřepají k odstranění bublin.

Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 540 nm s použitím slepé zkoušky jako kompenzačního roztoku. Pro každý reakční roztok se odečte absorbance příslušného korekčního roztoku. Sestrojí se kalibrační křivka z absorbancí pěti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahů acetylcholiniumchloridu. Z křivky se odečte obsah acetylcholiniumchloridu ve zkoušených roztocích pro každý zkoušený objem. Vypočítá se průměr ze dvou hodnot.

1 mol acetylcholiniumchloridu (181,7 g) odpovídá 1 mol O-acetylu (43,05 g).

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je nejméně minimální účinné množství a nejvýše 115 % deklarovaného množství. Pokud byl při přípravě použit fenol, jeho množství 2,5 g/l (2.5.15).

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 3750 m.j. endotoxinu v jednotlivé lidské dávce.

Stanovení obsahu

Vi polysacharid se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) s použitím referenčního purifikovaného polysacharidu. Stanovené množství polysacharidu v dávce je 80 % až 120 % deklarovaného množství. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanoveného obsahu je v rozmezí 80 % až 120 %.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obale se uvede:

- počet mikrogramů polysacharidu v lidské dávce (25 μg),

- celkové množství polysacharidu v obalu.

Vaccinum febris typhoidis vivum perorale (stirpe Ty 21a) ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá perorální vakcína proti tyfu (kmen Ty 21a)

Je to lyofilizovaný přípravek živého mikroba Salmonella typhi kmene Ty 21a, vypěstovaného ve vhodné živné půdě. Pokud je vakcína podávána v tobolkách, vyhovuje požadavkům článku Capsulae.

Výroba

Výběr vakcinačního kmene

Hlavní charakteristikou kmene je nedostatek enzymu uridin difosfat-galaktosa-4-epimerasy. Aktivita galaktopermeasy, galaktokinasy a galaktosa-1-fosfat uridyl-transferasy jsou sníženy o 50 % až 90 %. Kmen neobsahuje Vi antigen, i když jsou růstové podmínky jakékoli. Sérum anti-O:9 aglutinuje kmen pouze tehdy, pěstuje-li se na půdě s obsahem galaktosy. Obsahuje bičíkový H:d antigen a netvoří sirovodík na Kliglerově agaru s obsahem železa. Kmen není virulentní pro myši. Buňky kmene Ty 21a lyzují, pokud se pěstují v přítomnosti 1 % galaktosy.

Bakteriální inokula

K přípravě vakcíny se používá systém jednotné inokulace. Pracovní inokula jsou nanejvýš první subkulturou matečného inokula. Konečná vakcína představuje nanejvýš čtvrtou subkulturu původní vakcíny, se kterou byly provedeny laboratorní a klinické zkoušky prokazující vhodnost kmene.

Pro přípravu pracovního inokula se použije pouze takové matečné inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.

Galaktosový metabolismus. Stanoví se spektrofotometricky; v cytoplazmě kmene Ty 21a není zjištěna žádná aktivita enzymu uridin difosfat-galaktosa-4-epimerasy.

Biosyntéza lipopolysacharidů. Lipopolysacharidy se extrahují metodou fenol-voda za tepla a zkoušejí chromatografií na molekulárním sítu. Kmen Ty 21a pěstovaný na půdě bez galaktosy vykazuje pouze přítomnost R typu lipopolysacharidu.

Sérologické charakteristiky. Kmen Ty 21a pěstovaný na syntetické půdě bez galaktosy se neaglutinuje specifickým anti-O:9 sérem. Vi antisérem se kmen Ty 21a neaglutinuje nikdy, bez ohledu na růstové podmínky. Kmen Ty 21a se aglutinuje H:d bičíkovým antisérem.

Biochemické markery. Kmen Ty 21a netvoří na Kliglerově agaru s obsahem železa sirovodík. Tato vlastnost slouží k jeho odlišení od ostatních galaktosa-epimerasa-negativních kmenů S. typhi.

Buněčný růst. Kmen Ty 21a lyzuje, když roste v přítomnosti 1 % galaktosy.

Množení a získávání bakterií

Bakterie z pracovního inokula se pomnoží v prekultuře, připraví se jedna subkultura a pak se při 30 °C pěstují 13 h až 15 h ve vhodné půdě obsahující 0,001 % galaktosy. Bakterie se sklidí tak, aby nedošlo ke kontaminaci jinými mikroorganismy.

K přípravě lyofilizované sklizně lze použít pouze takové jednotlivé sklizně, které vyhovují následujícím požadavkům.

Hodnota pH. 6,8 až 7,5; měří se kultura.

Optická hustota. 6,5 až 11,0; měřeno při 546 nm. Před měřením se kultura naředí tak, aby se naměřená hodnota pohybovala mezi 0,1 a 0,5 a podle ředění se pak skutečná hustota vypočítá.

Zkouška totožnosti. Bakterie se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.

Lyofllizovaná sklizeň

Sklizeň se smíchá s vhodným stabilizátorem a lyofilizuje postupem zaručujícím přežití nejméně 10 % bakterií a na takový obsah vody, který je prokazatelně vhodný pro stabilitu vakcíny. K vakcíně se nepřidává žádná protimikrobní konzervační látka.

K přípravě konečné várky vakcíny se použije pouze taková lyofllizovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Počet živých bakterií. Nejméně 1 . 10 11 živých mikrobů S. typhi kmene Ty 21a v gramu.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 1,5 % až 4,0 %.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví aseptickým smícháním jedné nebo více lyofilizovaných sklizní s vhodným sterilním vehikulem.

K přípravě šarže se použije pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícímu požadavku.

Počet živých bakterií. Nejméně 40 . 10 9 živých mikrobů S.typhi kmene Ty 21a v gramu.

Šarže

Konečná várka vakcíny se rozplní za aseptických podmínek do kapslí se stěnou odolnou proti žaludeční šťávě nebo do jiných vhodných obalů.

K použití se uvolní pouze šarže, která vyhovuje požadavkům dále uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Počet živých bakterií. Výjimkou je požadovaná hodnota počtu živých bakterií, která je nejméně 4 . 10 9 živých bakterií v dávce.

Zkouška totožnosti

Bakterie ze zkoušeného přípravku se pěstují na agarové půdě obsahující 1 % galaktosy a modř bromthymolovou. Vytvoří se světle modré, konkávní, vzhledem k lýze buněk průhledné kolonie. Neobjeví se žádné žluté (galaktosu fermentující) kolonie.

Zkoušky na čistotu

Cizí mikroorganismy (2.6.12, 2.6.13). Zkouška se provede na vhodných selektivních půdách. Plotnovou metodou se stanoví celkový počet živých mikroorganismů. Počet cizích mikroorganismů v jedné dávce není větší než 10 bakterií a 20 hub. Není nalezen žádný patogenní mikroorganismus, zvláště Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ani salmonela jiného kmene než Ty 21a.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 1,5 % až 4,0 %; stanoví se z obsahu jedné tobolky nebo obalu.

Stanovení počtu živých bakterií

Ke zkoušce se použije nejméně pět dávek. Obsah jednotlivých dávek se v chladném prostředí zhomogenizuje při 4 °C v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) za použití mixéru a tolika skleněných kuliček, aby vyčnívaly z tekutiny. Ihned po homogenizaci se připraví vhodné ředění suspenze ve vychlazeném rozpouštědle a očkuje se na agar s přísadou mozkosrdcové infuze. Inkubuje se 20 h až 36 h při (36 ± 1) °C. Zkoušený přípravek obsahuje v jedné dávce nejméně 2 .10 9 živých mikrobů S. typhi Ty 21a.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- minimální množství živých bakterií v jedné dávce,

- že vakcína je pouze pro perorální použití.

Vaccinum hepatitidis A inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti hepatitidě A

Je to tekutý přípravek z vhodného kmene viru hepatitidy A pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou. Vakcína je opalescentní suspenze.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace a na systému buněčné banky. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu.

Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce neškodnosti pro imunní séra a humánní vakcíny (2.6.9).

Pokud není doloženo a schváleno jinak, virus v konečném přípravku neprojde více pasážemi z matečného inokula než virus použitý k přípravě vakcíny, která vyhověla v klinických studiích z hlediska neškodnosti a účinnosti.

Referenční přípravek. Část šarže, která byla prokazatelně nejméně tak imunogenní jako šarže, jež v klinické studii na mladých zdravých dospělých vykazovala nejméně 95% sérokonverzi, odpovídající hladině neutralizačních protilátek považované za ochrannou po úplné primární imunizaci, se používá jako referenční přípravek. Jako ochranná hladina protilátek se uznává 0,02 m.j./ml, stanoveno metodou ELISA.

Substrát pro pomnožování viru

Virus se pomnožuje v linii lidských diploidních buněk (5.2.3) nebo v kontinuální linii buněk schválené oprávněnou autoritou.

Inokula

Kmen viru hepatitidy A, který se používá k přípravě matečného inokula, se identifikuje vývojovými záznamy, které obsahují informace o původu kmene a o následné manipulaci s ním.

Pouze virus, který odpovídá následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování.

Zkouška totožnosti. Každé matečné a pracovní inokulum viru se identifikuje jako virus hepatitidy A pomocí specifických protilátek.

Koncentrace viru. K zajištění stejnorodosti výroby se stanoví koncentrace viru v matečném a pracovním inokulu.

Cizí agens. Matečná a pracovní inokula vyhovují požadavkům na inokula pro virové vakcíny (2.6.16). Jestliže byla pro izolaci virového kmene použita kultura primárních opičích buněk, provedou se navíc opatření, aby se zajistilo, že kmen není kontaminován opičími viry, jako jsou virus opičí imunodeficience, Ebola virus a Marburg virus.

Pomnožování viru a sklizeň

Veškeré činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostorách, kde nejsou zpracovávány jiné buňky. Při přípravě média pro kultivaci buněk se používá schválené sérum zvířecího (nikoli lidského) původu. Sérum a trypsin používané při přípravě buněčné suspenze a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens: trypsin vyhovuje článku Trypsinum. Médium pro kultivaci buněk může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky). Několikanásobné sklizně z téže buněčné produkční kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň.

Pouze jednotlivá sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít k přípravě vakcíny. Jestliže stanovení poměru virové koncentrace k obsahu antigenu provedené na vhodném počtu sklizní prokazuje pravidelnost výroby, může se tato zkouška následně vypustit při rutinní kontrole.

Zkouška totožnosti. Zkouška na obsah antigenu slouží také jako zkouška totožnosti jednotlivé sklizně.

Bakterie a houby (2.6.1). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na mykoplazmata; na každou půdu se použije 1 ml.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z kultur produkčních buněk vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Obsah antigenu. Stanoví se obsah antigenu hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) ke sledování pravidelnosti výroby; obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Poměr koncentrace viru k obsahu antigenu. Stálost poměru koncentrace infekčního viru, stanoveného vhodnou metodou na buněčné kultuře, k obsahu antigenu je stanoven validací na vhodném počtu jednotlivých sklizní.

Purifikace a purifikovaná sklizeň

Sklizeň, která může být spojením několika jednotlivých sklizní, se purifikuje validovanými metodami. Jsou-li pro pomnožení viru použity kontinuální buněčné linie, purifikační proces prokazatelně zahrnuje také důsledné snížení hladiny DNK hostitelských buněk.

Pouze purifikovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, může být použita k přípravě inaktivované sklizně.

Koncentrace viru. Koncentrace infekčního viru v purifikované sklizni se stanoví na vhodné tkáňové kultuře ke sledování pravidelnosti výroby a jako počáteční bod pro sledování inaktivační křivky.

Poměr antigenu k celkové bílkovině. Stanoví se obsah antigenu viru hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Stanoví se obsah celkové bílkoviny validovanou metodou. Poměr obsahu antigenu viru hepatitidy A k obsahu celkové bílkoviny je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v ekvivalentu jedné lidské dávky, stanoveno vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Jestliže to dovolí výrobní proces, lze použít jiné vhodné bílkovinné markery k průkazu účinné purifikace.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Je-li pro pomnožení viru použita kontinuální buněčná linie, obsah zbytkové DNK hostitelských buněk, stanovený vhodnou imunochemickou metodou, jak je popsáno v článku Producta ab ADN recombinante, je nejvýše 100 pg v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na purifikované sklizni (nebo na inaktivované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.

Inaktivace a inaktivovaná sklizeň

Několik purifikovaných sklizní se může spojit před inaktivací. K zamezení interference v inaktivačním procesu se předchází tvorbě virových agregátů nebo se virové agregáty odstraňují bezprostředně před nebo během inaktivačního postupu. Virová suspenze se inaktivuje validovanou metodou; metoda je prokazatelně schopna stejnoměrně inaktivovat virus hepatitidy A bez poškození antigenní a imunogenní aktivity; jako část validační studie je nakreslena inaktivační křivka reprezentující koncentraci zbytkového živého viru měřenou nejméně třikrát (např. ve dni 0, 1 a 2 inaktivačního postupu). Při použití formaldehydu k inaktivaci se přítomnost zbytků volného formaldehydu stanovuje na konci inaktivačního procesu.

Pouze inaktivovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na přítomnost zbytků infekčního viru hepatitidy A inokulací určitého množství inaktivované sklizně, odpovídající 5 % šarže, ale nejvýše 1500 dávek vakcíny do buněčných kultur téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Po dvou pasážích se provede zkouška vhodné citlivosti na přítomnost zbytkového infekčního viru. Ve vzorcích odebraných na konci inaktivace se nenaleznou známky pomnožení viru hepatitidy A. Jako pozitivní kontrola se souběžně použije infekční virus k prokázání vnímavosti buněk a nepřítomnosti interference.

Sterilita. (2.6.1). Inaktivovaná virová sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Jestliže se v konečném výrobku nemůže provést validní test na bakteriální endotoxiny, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška v inaktivované sklizni. Obsahuje nejvýše 2 m.j. endotoxinu v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Obsah antigenu. Vhodnou imunochemickou metodou se stanoví obsah antigenu viru hepatitidy A (2.7.1).

Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na inaktivované sklizni (nebo na purifikované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakciny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných sklizní. Mohou se přidat schválená adjuvans, stabilizátory a protimikrobní konzervační látky.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Sterilita. (2.6.1). Konečná várka vakciny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Množství je 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Šarže

Konečná várka vakciny se asepticky rozplní do sterilních obalů. Obaly se potom uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkoušky totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti se může uvolnit k použití. Za předpokladu, že zkouška na volný formaldehyd (přichází-li v úvahu) a stanovení obsahu protimikrobních konzervačních látek (přichází-li v úvahu) a stanovení účinnosti byly provedeny v konečné várce vakcín s vyhovujícími výsledky, lze je u šarže vypustit.

Zkoušky totožnosti

Obsah antigenu viru hepatitidy A ve vakcíně se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití specifických protilátek nebo zkouškou imunogenity na myších, popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Jestliže byl použit jako adsorbent hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Při použití formaldehydu pro inaktivaci vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví jejich množství vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Množství není nižší než nejnižší prokazatelně účinné množství a vyšší než 115 % množství uvedeného v označení.

Sterilita (2.6.1). Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 2 m.j. endotoxinu v jedné lidské dávce. Nelze-li provést validovanou zkoušku s konečnou šarží, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška s inaktivovanou sklizní.

Stanovení účinnosti

Buďto se účinnost vakciny stanoví porovnáním množství nezbytného k vytvoření specifických protilátek u myší s množstvím referenčního přípravku potřebným k vyvolání téhož účinku, nebo se provede validované stanovení obsahu antigenu in vitro.

Zkouška na myších uvedená dále je příkladem metody, která byla shledána vhodnou pro danou vakcínu; mohou se použít i jiné validované metody.

Požadavek na účinnost. Horní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené relativní účinnosti je nejméně 1,0.

Výběr a rozdělení zkoušených zvířat. Použijí se zdravé myši z jednoho chovu, staré 5 týdnů a prokazatelně vhodného kmene. Používají se zvířata téhož pohlaví. Zvířata se rozdělí do nejméně sedmi stejných skupin o počtech vhodných pro požadavky zkoušky.

Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. K ředění se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující hliníkové adjuvans použité pro vakcínu. Připraví se nejméně tři ředění zkoušené vakcíny a referenčního přípravku. Každému zvířeti ve skupině se subkutánně vstříkne nejvýše 1,0 ml ředění určeného pro skupinu. Kontrolní skupině neočkovaných zvířat se subkutánně vstříkne stejné množství výše uvedeného roztoku k ředění. Po 28 až 32 dnech se zvířatům podá anestezie, vykrvácejí se a jednotlivá séra se zpracují odděleně. V jednotlivých sérech se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) stanoví obsah specifických protilátek proti hepatitidě A.

Výpočet. Výpočet se provede obvyklými statistickými metodami pro zkoušky s kvantitativní odpovědí (např. 5.3 Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek, sekce 4).

Podle rozložení reakčních hladin naměřených ve všech sérech nevakcinované skupiny se stanoví maximální reakční hladina, kterou lze nalézt u nevakcinovaných zvířat pro tuto zvláštní zkoušku. Odpověď ve vakcinovaných skupinách, která přesahuje tuto hladinu, je definována jako sérokonverze.

Provede se vhodná transformace na procentové vyjádření zvířat vykazujících sérokonverzi v každé skupině (např. probitová transformace) a provede se analýza dat podle rovnoběžného modelu log dávky - odpověď. Stanoví se účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu k referenčnímu přípravku.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

- pro zkoušenou i referenční vakcínu leží ED 50 mezi nejnižší a nejvyšší dávkou podanou zvířatům,

- statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti,

- předpokládané limity odhadované relativní účinnosti leží mezi 33 % a 300 % stanovené účinnosti.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede biologický původ buněk a adjuvans použité pro přípravu vakcíny.

Vaccinum hepatitidis B (ADNr) ⟪MEDIA:img_001⟫

Vakcína proti hepatitidě B (rDNK) rekombinantní

Je to přípravek z povrchového antigenu viru hepatitidy B, základního proteinu viru hepatitidy B. Tento antigen se získává rekombinantní DNK technologií.

Přípravek vyhovovuje požadavkům článků Producta ab ADN recombinante a Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Viz článek Producta ab ADN recombinante, zvláště v částech Klonování a exprese, Systém buněčných bank, Validace buněčných bank, Validace výrobního postupu a Pravidelnost výroby.

Přípravek prokazatelně podněcuje tvorbu specifických ochranných protilátek u člověka. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stále vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu a neškodnost.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9)

Přípravek se vyrábí expresí virového genu kódujícího povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg) v kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae) nebo v savčích buňkách (buňky ovaria čínského křečka nebo jiných vhodných buněčných linií) purifikací výsledného HBsAg a převedením tohoto antigenu do imunogenního přípravku. Vhodnost a neškodnost buněk schvaluje oprávněná autorita.

Přípravek může obsahovat produkt S genu (hlavní bílkovina), kombinaci S genového a pre-S2 genového produktu (střední bílkovina), nebo kombinaci S genového, pre-S2 genového a pre-S1 genového produktu (velká bílkovina).

Referenční přípravek. Jako referenční přípravek se používá část šarže reprezentující šarži vakcíny, která v klinické studii na mladých zdravých dospělých jedincích prokazatelně vykazuje nejméně 95% sérokonverzi (HBsAg protilátkový titr je větší než 10 m.j. v litru po úplné primární imunizaci).

Charakteristika látky

K charakteristice antigenu se provede vývojová studie, ve které se určí jeho úplná bílkovinná, lipidová a sacharidová struktura. Morfologické charakteristiky antigenních částic se stanoví elektronovou mikroskopií. Vhodná denzita antigenních částic se stanoví fyzikálně-chemickými metodami, např. gradientovou centrifugací Charakterizují se antigenní epitopy. Bílkovinná frakce antigenu se charakterizuje primární strukturou (např. stanovením aminokyselinového složení, částečnou analýzou aminokyselinové sekvence a mapováním peptidů).

Kultura a sklizeň

Totožnost, mikrobiologická čistota, plazmidová retence a konzistence sklizně jsou určeny vhodným výrobním uspořádáním. Jestliže jsou použity savčí buňky, provedou se zkoušky na cizí antigeny a mykoplazmata podle stati Důkaz cizích antigenů v lidských virových vakcínách (2.6.16).

Přečištěný antigen

Pro přípravu konečné várky se použije pouze přečištěný antigen, který odpovídá následujícím požadavkům.

Celková bílkovina. Stanoví se validovanou metodou. Obsah je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek.

Totožnost a obsah antigenu. Množství a specificita HBsAg se stanoví porovnáním s mezinárodním standardem HBsAg subtypu ad nebo s národním referenčním přípravkem za pomoci vhodné imunochemické metody (2.7.1), jako je radioimunoanalýza, enzymové imunosorbentové stanovení (ELISA), imunoblot (přednostně se užívají monoklonální protilátky přímo proti protektivnímu epitopu), nebo jednoduchou radiální difuzí. Poměr antigenu k bílkovině je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek. Molekulová hmotnost v hlavním pásu zjištěná elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným (SDS-PAGE) za redukovaných podmínek odpovídá očekávané hodnotě z genové sekvence a možné glykosylace.

Čistota antigenu. Stanoví se srovnáním s referenčním přípravkem za použití kapalinové chromatografie nebo jiné vhodné metody, jako je SDS-PAGE s barvením modří kyselou 92 a stříbrem.

Vhodná metoda musí být dost citlivá k detekci možného znečištění v koncentraci 1 % celkové bílkoviny. Nejméně 95 % celkové bílkoviny tvoří povrchový antigen hepatitidy B.

Složení. Stanoví se obsah bílkovin, lipidů, nukleových kyselin a sacharidů.

DNK hostitelských buněk a vektorem derivovaná DNK. Nejvýše 10 pg DNK v množství přečištěného antigenu odpovídajícím jedné lidské dávce vakcíny. Stanoví se u přípravků vyrobených pomocí savčích buněk.

Cesium. Jestliže se při výrobě použijí cesiové soli, provede se v přečištěném antigenu stanovení zbytků cesia. Obsah je v rozmezí schváleném pro specifický přípravek.

Sterilita (2.6.1). Přečištěný antigen vyhovuje zkoušce na sterilitu. Na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Další zkoušky se mohou u přečištěného antigenu požadovat v závislosti na použité výrobní metodě: např. stanovení zbytků zvířecího séra, jestliže byly pro výrobu použity savčí buňky, nebo zkoušky na zbytky chemikálií používaných při extrakci a čištění.

Konečná várka vakcíny

Vakcína může obsahovat protimikrobní konzervační látku a adjuvans.

Pouze várka, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu šarže.

Protimikrobní konzervační látky. Kde jsou použity, stanoví se jejich obsah vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je v rozmezí 85 % až 115 % deklarovaného množství.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu. Na každou živnou půdu se použije 10 ml konečné várky.

Šarže

K použití se propustí jenom ta konečná šarže, která vyhovuje každému požadavku uvedenému dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Jestliže zkoušky na volný formaldehyd, obsah protimikrobních konzervačních látek a účinnost na zvířatech byly provedeny v konečné várce vakcíny s vyhovujícími výsledky, mohou být tyto zkoušky u šarže vypuštěny.

Zkouška totožnosti

Totožnost přípravku se prokáže stanovením účinnosti nebo ve vhodných případech elektroforetickým profilem.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Jestliže je použit hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý jako sorbent, vyhovuje přípravek zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Při použití formaldehydu vyhovuje přípravek zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Jestliže byly použity, stanoví se jejich obsah vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Jejich obsah není nižší než prokazatelně nejmenší účinné množství a není vyšší než 115 % deklarovaného množství.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se každému králíkovi nitrožilně vstříkne ekvivalent lidské dávky.

Místo zkoušky na pyrogenní látky se může použít validovaná zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14).

Stanovení účinnosti

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví buď na zvířatech porovnáním jeho schopnosti v daných podmínkách indukovat tvorbu specifických protilátek anti-HBsAg u myší nebo morčat se stejnou schopností referenčního přípravku, nebo stanovením obsahu antigenu validovanou metodou in vitro.

Požadavek na účinnost. Horní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené relativní účinnosti je nejméně 1,0.

Zkouška na zvířatech

Výběr a rozdělení zvířat. Použijí se zdravé myši z jednoho chovu, staré asi 5 týdnů. Použitý kmen myší pro tuto zkoušku dává signifikantní směrnici v křivce závislosti odpovědi na dávce antigenu: vhodné jsou myši s haplotypem H-2q nebo H-2d. Také jsou vhodná zdravá morčata hmotnosti 300 g až 350 g (stará asi 7 týdnů) z jednoho chovu. Zvířata jsou stejného pohlaví. Rozdělí se do nejméně sedmi stejných skupin o počtu vhodném pro hodnocení výsledků.

Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku. K ředění přípravku se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující hlinité adjuvans nebo jiné vhodné rozpouštědlo. Připraví se nejméně tři vhodná ředění zkoušeného přípravku a souhlasná ředění referenčního přípravku. Ředění se intraperitoneálně vstříknou v množství nejvýše 1,0 ml každému zvířeti ve skupině, pro kterou je ředění určeno. Jedna skupina zvířat zůstane neočkována, vstříkne se jí pouze intraperitoneálně stejný objem ředicího roztoku. Ve vhodném časovém intervalu (např. mezi čtyřmi až šesti týdny) se zvířatům v anestezii odebere krev a odděleně se získají jednotlivá séra. Pro každé sérum se provede vhodná imunoanalýza pro stanovení specifických HBsAg protilátek (2.7.1).

Výpočty. Výpočty se provedou běžnými statistickými metodami pro zkoušky s kvantitativní odpovědí (5.3 Statistická analýza výsledků biologických zkoušek, sekce 4).

Z rozložení reakčních hodnot naměřených ve všech sérech neočkované skupiny se stanoví nejvyšší reakční hladina pro nevakcinované zvíře. Všechny odpovědi u vakcinovaných zvířat, které převyšují tuto hodnotu, se označí za sérokonverzi.

Procento zvířat vykazujících sérokonverzi v každé skupině se vhodně transformuje (např. probitovou transformací) a použije se model rovnoběžnosti křivek závislosti log dávky a odpovědi. Relativní účinnost zkoušeného přípravku se stanoví vzhledem k referenčnímu přípravku.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

- pro zkoušený a referenční přípravek leží ED 50 mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou zvířatům,

- statistická analýza neukazuje žádnou odchylku od podmínek linearity ani modelu rovnoběžnosti,

- meze spolehlivosti relativní účinnosti jsou mezi 33 % a 300 % stanovené účinnosti.

ED 50 (50% účinná dávka) je statisticky vypočtená dávka vakcíny, která v podmínkách zkoušky u 50 % zvířat indukuje specifické protilátky na relevantní vakcinační antigeny.

Metody in vitro

Místo zkoušky na zvířatech lze použít některé validované metody in vitro. Vhodné jsou enzymově imunosorbentová stanovení (ELISA) a radioimunoanalýza s použitím monoklonálních protilátek specifických pro ochranu indukující epitopy HBsAg.

Vhodný počet ředění zkoušeného přípravku se porovnává s referenčním přípravkem za použití modelu rovnoběžnosti k analýze dat, která jsou vhodným způsobem transformována. Soupravy k měření HBsAg in vitro jsou běžně dostupné a mohou se přizpůsobit ke stanovení účinnosti vakcíny in vitro.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- obsah HBsAg v obalu,

- typ buněk použitých k výrobě vakcíny,

- název a množství adjuvans,

- že se vakcína před použitím roztřepe,

- že vakcína nesmí zmrznout.

Vaccinum hepatitidis contagiosae caninae vivum cryodesiccatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti infekční hepatitidě psů lyofílizovaná

Je to přípravek obsahující jeden nebo více oslabených kmenů psích adenovirů.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Oslabený virus se pomnožuje ve vnímavé buněčné kultuře (5.2.4).

Výběr vakcinačního kmene

K přípravě vakcíny se může použít pouze kmen viru prokazatelně uspokojivý z hlediska oslabení a imunogenity. K průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se použijí následující zkoušky.

Oslabení. Když se vnímavému štěněti starému osm až šestnáct týdnů intravenózně vstříkne objem virové suspenze odpovídající jedné dávce vakcíny, nevyvolá příznaky onemocnění, ale u zvířete se do 21 dní vyvinou specifické neutralizující protilátky.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k prokázání imunogenity kmene.

Zkoušení šarže

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s vyhovujícím výsledkem na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěna, jestliže k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína rozpustí předepsaným způsobem a smíchá s jedním nebo více specifickými antiséry, nevyvolává již ve vnímavé buněčné kultuře specifický cytopatický efekt.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým, 8 až 16 týdnů starým štěňatům, která jsou prosta specifických neutralizačních protilátek, se každému podá způsobem uvedeným v označení dvojnásobek dávky rozpuštěného přípravku. Zvířata se pozorují 21 dní. Zvířata zůstanou zcela zdravá a nemají příznaky keratitidy.

Cizí viry.

A. Rozpuštěná vakcína se smíchá s jedním nebo více specifickými antiséry. Ve vnímavé buněčné kultuře již nevyvolá cytopatický efekt, ani se v ní nedokážou hemaglutinační ani hemadsorpční látky.

B. Zkouška se provede na myších hmotnosti 11 g až 15 g. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml rozpuštěné vakcíny. Použije se tolik myší, aby se podaly 3/10 dávky vakcíny, nejméně však deset myší. Zvířata se pozorují 21 dní. Jestliže během prvních 48 h uhynou více než dvě myši, zkouška se opakuje. Od třetího do jedenadvacátého dne po podání nevykážou myši žádné abnormality, jež by bylo možno přisoudit vakcíně.

Bakterie a houby. Rozpuštěný přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Rozpuštěná vakcína vyhovuje ve zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Titr viru v rozpuštěném přípravku se stanoví na vnímavé buněčné kultuře. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství virových částic, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použije se sedm vnímavých štěňat ve stáří osmi až šestnácti týdnů, která nemají protilátky proti psím adenovirům. Způsobem uvedeným v označení se každému z pěti zvířat vstříkne objem rozpuštěné vakcíny obsahující množství viru, které odpovídá nejnižšímu titru uvedenému v označení. Dvě štěňata se ponechají jako kontrola. Všechna zvířata se pozorují 21 dní. Potom se každému zvířeti nitrožilně vstříkne takové množství virulentního kmene infekční hepatitidy psů, které u vnímavých psů stačí k vyvolání úhynu nebo typických příznaků nemoci. Zvířata se pozorují dalších 21 dní. Vakcinovaná zvířata zůstanou zdravá a kontrolní zvířata buďto uhynou, nebo jeví typické příznaky vážné infekce. Pokud jedno z kontrolních zvířat nemá žádné příznaky nemoci, stanovení se opakuje.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum influenzae equi inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti chřipce koní

Je to suspenze jednoho nebo více kmenů virů chřipky koní inaktivovaná takovým způsobem, aby se nenarušila imunogenita kmenů.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Každý kmen viru se inokuluje odděleně do alantoidní dutiny kuřecích embryí starých 9 až 11 dní pocházejících ze zdravého chovu. Vejce se inkubují při vhodné teplotě 2 až 3 dny. Potom se odebere alantoidní tekutina. Virové suspenze každého kmene se odeberou odděleně a inaktivují se. Je-li to třeba, mohou se purifíkovat. Mohou se přidat i vhodná adjuvancia a protimikrobní konzervační látky. Vakcína se může lyofilizovat.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně dostatečná z hlediska imunogenity. K prokázání účinnosti se může použít zkouška dále popsaná (5.2.7).

Imunogenita. Zkouška na koních popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se může použít při prokazování imunogenity.

Zkoušení šarže

Pokud bylo stanovení účinnosti na koních provedeno s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěna, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkoušky totožnosti

Přípravek u vnímavých druhů vyvolá tvorbu specifických protilátek detekovatelných hemaglutinačně inhibičním testem.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Nejméně dvěma koňům se vstříkne na dvě různá místa zkoušený přípravek v dávce uvedené v označení. Za 4 týdny se vakcinace opakuje. Zvířata se pozorují dalších 10 dní. Neprojeví se žádná významná místní ani celková reakce.

Inaktivace. Do alantoidní dutiny deseti kuřecích embryí 9 až 11 dní starých se naočkuje po 0,2 ml zkoušeného přípravku. Embrya se inkubují 3 dni ve vhodné teplotě. Smrt embrya do 24 h od inokulace se považuje za nespecifický úhyn a vejce se vyřadí. Z každého embrya se odebere alantoidní tekutina a vytvoří se směsný vzorek. Stejným způsobem se na embryích provede druhá pasáž. Po čtyřech dnech inkubace nevykazuje alantoidní tekutina těchto kuřecích embryí žádnou hemaglutinační účinnost.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

a) Na koních. Každému z pěti vnímavých séronegativních koní se doporučeným způsobem vstříkne jedna dávka zkoušeného přípravku. Za dobu uvedenou v označení jako interval mezi první a druhou vakcinací se vstříkne objem odpovídající druhé dávce vakcíny. Každému zvířeti se odeberou dva vzorky krve, první za týden po první vakcinací, druhý za dva týdny po druhé vakcinací. Z každého vzorku krve se oddělí sérum. Séra se inaktivují zahřátím 30 min na 56 °C. K jednomu objemovému dílu séra se přidají tři objemové díly tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,4 a čtyři objemové díly suspenze kaolinu lehkého R ve stejném tlumivém roztoku (250 g/l). Všechny směsi se 10 min protřepávají při pokojové teplotě. Poté se odstředí, oddělí se supernatant, který se smíchá s koncentrovanou suspenzí kuřecích erytrocytů. Inkubuje se 60 min při 37 °C a odstředí se. Ředění získaného séra je 1 : 8. Ke zkoušení sér se použije antigen nebo antigeny připravené z kmene nebo kmenů použitých k výrobě vakcíny. Z každého zředěného séra se připraví řada dvojnásobných ředění. K 0,025 ml naředěného séra se přidá 0,025 ml suspenze každého antigenu (který byl napřed ošetřen etherem R) obsahující čtyři hemaglutinační jednotky. Směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě a poté se přidá 0,05 ml 0,5% suspenze kuřecích erytrocytů. Nechá se dále stát 1 h při pokojové teplotě a zaznamená se poslední ředění séra, ve kterém ještě došlo k úplné inhibici hemaglutinace.

Titr protilátek u sér odebraných po druhé vakcinací není nižší než 1 : 64 (do hodnoty ředění se nezapočítávají objemy suspenzí antigenu a erytrocytů). Pokud u některých zvířat ukazuje nalezený titr protilátek po první vakcinací, že to je anamnestická odpověď, nebere se tento výsledek v úvahu, ale provede se za stejných podmínek doplňující stanovení s tolika zvířaty, kolik jich mělo anamnestickou odpověď.

b) Na morčatech. Každému z deseti morčat prostých specifikovaných protilátek se podkožně vstříkne dávka uvedená v označení. Za 21 dní se odeberou vzorky krve a oddělí se sérum. Séra se inaktivují zahřátím 30 min na 56 °C. K jednomu objemovému dílu séra se přidají tři objemové díly tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,4 a čtyři objemové díly suspenze kaolinu lehkého R ve stejném tlumivém roztoku (250 g/l). Všechny směsi se 10 min protřepávají při pokojové teplotě. Poté se odstředí, oddělí se supernatant, který se smíchá s koncentrovanou suspenzí kuřecích erytrocytů. Inkubuje se 60 min při 37 °C a odstředí se. Ředění získaného séra je 1 : 8. Ke zkoušení sér se použije antigen nebo antigeny připravené z kmene nebo kmenů použitých k výrobě vakcíny. Z každého zředěného séra se připraví řada dvojnásobných ředění. K 0,025 ml každého naředěného séra se přidá 0,025 ml suspenze každého antigenu (který byl napřed ošetřen etherem R) obsahující čtyři hemaglutinační jednotky. Směsi se nechají 30 min stát při pokojové teplotě a poté se přidá 0,05 ml 0,5% suspenze kuřecích erytrocytů. Nechá se dále stát 1 h při pokojové teplotě a zaznamená se poslední ředění séra, ve kterém ještě došlo k úplné inhibici hemaglutinace.

Titr protilátek u žádného séra v žádné zkoušce není nižší než 1 : 16 (do hodnoty ředění se nezapočítávají objemy suspenzí antigenu a erytrocytů).

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- stáří, ve kterém by se měla zvířata vakcinovat,

- interval mezi první a druhou vakcinací,

- požadovaná revakcinace.

Vaccinum influenzae inactivatum ad suem ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti chřipce prasat

Je to vodná suspenze, olejová emulze nebo lyofilizovaný přípravek jednoho nebo více inaktivovaných kmenů prasečího nebo lidského chřipkového viru. Vhodné kmeny obsahují jak hemaglutinin, tak neuraminidasu.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnožuje v alantoidní dutině kuřecích embryí ze zdravého chovu (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4).

Každý virový kmen se pomnožuje odděleně. Jednotlivé suspenze se shromažďují odděleně a inaktivují metodou, která vylučuje poškození imunogenity. Je-li to třeba, purifikují se.

S každou šarží antigenu se ihned po inaktivaci provede pomnožovací zkouška na zbylý infekční virus chřipky pasážováním ve stejném typu substrátu, jaký byl použit při výrobě (kuřecí embrya nebo buněčné kultury), nebo v substrátu, u něhož byla prokázána nejméně stejná citlivost. Ke zkoušce použité množství inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Neprokáže se žádný živý virus.

Pokud se zkouška inaktivace u vakcíny z buněčných kultur nemůže provést u hotové šarže pro přítomnost olejového adjuvans, provede se zkouška na zbylý infekční chřipkový virus ve várce každé vakcíny bezprostředně před přidáním adjuvans. Provedou se dvě pasáže ve stejném typu substrátu, jaký byl použit při výrobě vakcíny. Množství inaktivovaného viru použité v této zkoušce je nejméně deset dávek vakcíny. Neprokáže se žádný živý virus.

Vakcína může obsahovat jedno nebo více vhodných adjuvans; může být lyofilizovaná.

Výběr složení vakcíny

Výběr kmenů je založen na antigenních typech a subtypech zjištěných v Evropě. Prokáže se, že vakcína je dostatečná z hlediska bezpečnosti a imunogenity pro prasata. Bezpečnost (5.2.6) a účinnost (5.2.7) se mohou prokázat dále uvedenými zkouškami.

Bezpečnost.

A. Zkouška se provede s každou kategorií zvířat, pro kterou je přípravek určen (prasnice, výkrmová prasata). Použitá zvířata nemají protilátky proti viru chřipky prasat. Nejméně deseti zvířatům se vstříkne doporučeným způsobem po dvou dávkách vakcíny. Po čtrnácti dnech se každému zvířeti vstříkne jedna dávka vakcíny a zvířata se pozorují ještě 14 dní. Během 28 dní trvání zkoušky se neprojeví žádná významná místní ani celková reakce.

B. K vyhodnocení bezpečnosti se použijí též zvířata ze zkoušky imunogenity. Každému vakcinovanému zvířeti se změří rektální teplota při vakcinaci, za 24 h a za 48 h. Nezjistí se významný účinek na rektální teplotu, ani jiná systémová reakce (např. anorexie). Při porážce se vyšetří místo podání a nezjistí se žádná významná místní reakce.

C. K vyhodnocení bezpečnosti se použijí též zvířata z terénní zkoušky. Zkouška se provede s každou kategorií zvířat, pro kterou je přípravek určen (prasnice, výkrmová prasata). Použijí se nejméně tři skupiny po nejméně dvaceti zvířatech a jedna kontrolní skupina o nejméně deseti zvířatech. Každému zvířeti se změří rektální teplota při vakcinaci, za 24 h a za 48 h. Nezjistí se významný účinek na rektální teplotu. Při porážce se vyšetří místo podání a nezjistí se žádná významná místní reakce.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se může použít k důkazu imunogenity přípravku.

Zkouška účinnosti šarže

Dále popsaná zkouška se neprovádí při běžném zkoušení šarží. Provede se jednou nebo několikrát s určitou vakcínou podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Tam, kde se tato zkouška neprovede, použije se vhodná validovaná zkouška, kritéria pro přijetí jsou určena podle šarže, která má vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Následující zkouška se může použít po uspokojivé korelaci se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti po provedení statistického vyhodnocení.

Pěti séronegativním morčatům pět až sedm týdnů starým se podkožně vstříkne po jedné čtvrtině dávky uvedené v označení. Před vakcinací a za 21 dní po ní se zvířatům odebere krev. V každém vzorku se stanoví hladina specifických protilátek proti všem virovým kmenům ve vakcíně buďto hemaglutinačně inhibičním, nebo jiným vhodným testem. Přípravek vyhovuje, jestliže hladina protilátek není nižší než hladina zjištěná u té šarže, která dává uspokojivé výsledky při zkoušce účinnosti na prasatech (viz Stanovení účinnosti).

Zkoušky totožnosti

Jestliže přípravek neobsahuje adjuvans, provede se zkouška A, v opačném případě se provede zkouška B.

A. Antigenní specifita se potvrdí imunodifuzí s imunním sérem specifickým pro hemaglutininy a neuraminidasy obsažené ve zkoušeném přípravku.

B. Když se přípravek vstříkne dvěma zdravým a vnímavým zvířatům, vyvolá tvorbu specifických protilátek proti hemaglutininům a neuraminidasám v něm obsaženým. Protilátky se mohou zjistit vhodnou metodou, jako je imunodifuze.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma prasatům minimálního věku pro vakcinaci se vstříkne po dvojité dávce zkoušeného přípravku způsobem uvedeným v označení. Zvířata se pozorují 14 dní a poté se každému vstříkne jedna dávka zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují dalších 14 dní. Během 28 dní trvání zkoušky se neprojeví žádná významná místní ani celková reakce.

Inaktivace. Jestliže byl zkoušený přípravek vyroben na kuřecích embryích, naočkuje se po 0,2 ml do alantoidních dutin deseti kuřecích embryí, starých 9 až 10 dní, a nechá se 3 dni inkubovat při vhodné teplotě. Smrt embrya do 24 h od inokulace se považuje za nespecifický úhyn a vejce se vyřadí. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže přežije nejméně 80 % embryí. Z každého embrya se odebere alantoidní tekutina, stejné objemové díly všech tekutin se smíchají a stejným způsobem se na kuřecích embryích provede druhá pasáž. Inkubuje se 4 dny. Alantoidní tekutina z těchto kuřecích embryí nevykazuje žádnou hemaglutinační účinnost.

Jestliže byl zkoušený přípravek vyroben na buněčných kulturách, provede se vhodná zkouška na zbylý infekční virus chřipky s použitím dvou pasáží ve stejném typu buněčné kultury, jaký byl použit při výrobě. Nezjistí se žádný živý virus. Jestliže zkoušený přípravek obsahuje olejové adjuvans, které ruší při zkoušce, oddělí se vodná fáze takovým způsobem, který nezmenší schopnost zkoušky prokázat zbylý infekční virus chřipky.

Cizí viry. U prasat použitých ve zkoušce bezpečnosti se provedou zkoušky na protilátky. Zkoušený přípravek nevyvolá tvorbu jiných protilátek než proti viru chřipky. Zejména se nezjistí protilátky proti virům patogenním pro prasata nebo proti virům, které by mohly překážet při diagnóze infekčních onemocnění prasat (včetně virů ze skupiny pestivirů).

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Zkouška účinnosti se provede s každým kmenem použitým při výrobě. Použijí se vnímavá séronegativní prasata v minimálním věku doporučeném pro vakcinaci. Deset prasat se naočkuje, jak je doporučeno v označení, a deset prasat slouží jako kontrola. Za tři týdny po vakcinaci se všechna prasata v anestezii intratracheálně čelenžují vhodným množstvím terénního virulentního viru chřipky. Z každé skupiny se za 24 h po čelenži porazí pět prasat, přednostně při hypertermii. Změří se množství viru chřipky přítomné v určitém stejném množství rozdrceného pravého diafragmatického laloku plic poražených prasat. Množství viru v plicích vakcinovaných prasat je významně menší než v plicích kontrolních zvířat. U zbývající pětice prasat z obou skupin se 7 dní pozorují klinické příznaky, zejména se každý den u každého prasete zaznamenává rektální teplota. V den čelenže a o 4 dni později se každé prase zváží. Hmotnost vakcinovaných prasat za 4 dni po čelenži je významně vyšší. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže se u kontrolních prasat projeví závažné klinické příznaky (hypertermie, anorexie). U vakcinovaných prasat může být pozorován mírný vzestup rektální teploty.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článěk Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvedou virové kmeny obsažené ve vakcíně.

Vaccinum influenzae inactivatum ex corticis antigeniis praeparatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti chřipce (povrchový antigen)

Uvedené množství hemaglutinačního antigenů každého kmene obsažené ve vakcíně je 15 μg v dávce, pokud klinická situace nepodporuje použití jiného množství.

Vakcína je čirý roztok.

Výroba

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro humánní imunní séra a vakcíny (2.6.9).

Výběr vakcinačního kmene

Světová zdravotnická organizace vydává každý rok přehled světové epidemiologické situace, a je-li třeba, doporučuje nové kmeny odpovídající aktuální epidemiologické situaci. Tyto kmeny se použijí v souladu s platnými pravidly signatářských států Konvence o přípravě Evropského lékopisu. Nyní je obecnou praxí užívat vybrané kmeny mající vysoké výtěžky vhodných povrchových antigenů. Původ a průběh pasážování virových kmenů schvaluje oprávněná autorita.

Substrát pro pomnožení viru

Inokulum pro výrobu vakcíny se pomnoží v kuřecích embryích z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4), například kuřecích embryonálních fibroblastech nebo kuřecích ledvinných buňkách získaných z chovů kuřat prostých specifikovaných patogenů. Pro výrobu se virus každého kmene pěstuje v alantoidní dutině oplozených slepičích vajec ze zdravého chovu.

Virové inokulum

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Pracovní inokula jsou nejvýše patnáctou pasáží od schváleného vybraného kmene nebo od schváleného virového izolátu. Finální vakcínu představuje jedna pasáž z pracovního inokula. Pro potvrzení správnosti kmene chřipky se vhodnou metodou ověřuje hemaglutininový a neuramidasový antigen každého inokula. K přípravě monovalentní spojené sklizně se použije pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Provede se zkouška na mykoplazmata; použije se 10 ml.

Pomnožování a sklizeň viru

Do inokula se může přidat protimikrobní látka. Po inkubaci v kontrolované teplotě se odebere alantoidní tekutina a smíchá se do monovalentní spojené sklizně. Protimikrobní látka se může přidat i v době odběru. V žádném stupni výroby se nepoužije penicilín ani streptomycin.

Monovalentní spojená sklizeň

K omezení možnosti kontaminace se inaktivace zahájí co nejdříve možno po přípravě. Virus se inaktivuje metodou, u které byla výrobcem na třech po sobě jdoucích šaržích prokázána stejná účinnost. Inaktivační postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus chřipky bez zničení jeho antigenity; postup může změnit hemaglutinační a neuraminidasový antigen co nejméně. Inaktivační postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus ptačí leukózy a mykoplazmata. Jestliže se monovalentní spojená sklizeň uchovává po inaktivaci, použije se teplota (5 ± 3) °C. Při použití formaldehydového roztoku nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli inaktivace 0,2 g/l; při použití betapropiolaktonu jeho koncentrace nepřesahuje v žádné chvíli inaktivace 0,1 % (V/V).

Před nebo po inaktivačním postupu se monovalentní spojená sklizeň koncentruje a purifikuje vysokoobrátkovým odstřeďováním nebo jinou vhodnou metodou. Virové částice se rozštěpí na subjednotkové složky schválenými postupy a následně se purifikují, takže monovalentní várka sestává převážně z hemaglutinačních a neuraminidasových antigenů.

Jen taková monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Hemaglutinační antigen. Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s referenčním antigenem6) nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C.

Neuraminidasový antigen. Přítomnost a typ neuraminidasového antigenu se ověří vhodnou enzymatickou nebo imunologickou metodou na prvních třech monovalentních spojených sklizních z každého pracovního inokula.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Virová inaktivace. Provedou se zkoušky popsané v odstavci Zkoušky na čistotu.

Čistota. Čistota monovalentní spojené sklizně se zjišťuje polyakrylamidovou gelovou elektroforézou nebo jinou schválenou metodou. Prokážou se zejména hemaglutinační a neuraminidasové antigeny.

Chemikálie použité ke štěpení a purifikaci. Zkoušky na chemikálie použité ke štěpení a purifikaci se provedou s monovalentní spojenou sklizní, limity schvaluje oprávněná autorita.

Konečná várka vakcíny

Odpovídající množství monovalentních spojených sklizní se smíchá do konečné várky vakciny. K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakciny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látka. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je nejméně 85 % a nejvýše 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci. K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu. Za předpokladu, že zkouška na virovou inaktivaci byla provedena s vyhovujícím výsledkem u každé monovalentní spojené sklizně a že zkoušky na volný formaldehyd, ovalbumin a celkové bílkoviny byly provedeny s vyhovujícím výsledkem v konečné várce vakciny, mohou se u šarže tyto zkoušky vynechat.

Zkouška totožnosti

Antigenní specifita se ověřuje při stanovení obsahu.

Zkoušky na čistotu

Virová inaktivace. 0,2 ml zkoušeného přípravku se vstříkne do alantoidní dutiny každého z deseti oplozených vajec a inkubuje se 3 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že přežije osm embryí z deseti. Z každého přežívajícího embrya se odebere 0,5 ml alantoidní tekutiny a tekutiny se smíchají. 0,2 ml směsného vzorku se vstříkne dalším deseti oplozeným vejcím a inkubuje se 3 dny při teplotě 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že přežije osm embryí z deseti. Z každého přežívajícího embrya se odebere 0,1 ml alantoidní tekutiny a s každou tekutinou se samostatně provede hemaglutinační zkouška na přítomnost živého viru.

Jestliže je v některé tekutině zjištěna hemaglutinace, provede se další pasáž na vejcích a zkouška hemaglutinace; nezjistí se žádná hemaglutinace.

Celkové bílkoviny. Nejvýše 40 μg jiné bílkoviny než hemaglutinin na virový kmen v lidské dávce a nejvýše celkem 120 μg bílkoviny jiné než hemaglutinin v lidské dávce.

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látka. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je nejméně minimální účinné množství a nejvýše 115 % deklarovaného množství.

Ovalbumin. Nejvýše 1 μg ovalbuminu v lidské dávce, stanoveno vhodnou metodou s použitím vhodného referenčního přípravku ovalbuminu.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v lidské dávce.

Stanovení obsahu

Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s hemaglutinačním referenčním antigenem nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C. Interval spolehlivosti (P = 0,95) této zkoušky je v rozmezí 80 % až 125 % zjištěného obsahu. Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) odhadu obsahu hemaglutinačního antigenu je nejméně 80 % množství deklarovaného v označení pro každý kmen.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- že vakcína byla připravena na vejcích,

- kmen nebo kmeny chřipkových virů použitých k přípravě vakcíny,

- metoda inaktivace,

- obsah hemaglutininu v mikrogramech na virový kmen na dávku,

- sezóna, v níž je vakcína určena k ochraně.

Vaccinum influenzae inactivatum ex viris integris praeparatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti chřipce (celý virion)

Je to sterilní vodná suspenze kmene nebo kmenů chřipkového viru typu A nebo B nebo směs kmenů obou typů. Virové kmeny se pěstují odděleně v kuřecích embryích a inaktivují se tak, aby jejich antigenní vlastnosti zůstaly zachovány. Uvedené množství antigenu hemaglutininu každého kmene obsaženého ve vakcíně je 15 v dávce, pokud klinická situace nepodporuje použití jiného množství.

Vakcína je slabě opaleskující tekutina.

Výroba

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro humánní imunní séra a vakcíny (2.6.9).

Výběr vakcinačního kmene

Substrát pro pomnožení viru

Virové inokulum

Bakteriální a plísňová kontaminace. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Provede se zkouška na mykoplazmata; použije se 10 ml.

Pomnožování a sklizeň viru

Monovalentní spojená sklizeň

K omezení možnosti kontaminace se inaktivace zahájí co nejdříve možno po přípravě. Virus se inaktivuje metodou, u které byla výrobcem na třech po sobě jdoucích šaržích prokázána stejná účinnost. Inaktivační postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus chřipky bez zničení jeho antigenity; postup může změnit hemaglutinační a neuraminidasový antigen co nejméně. Inaktiva ční postup je prokazatelně schopný inaktivovat virus ptačí leukózy a mykoplazmata. Jestliže se monovalentní spojená sklizeň uchovává po inaktivaci, použije se teplota (5 ± 3) °C. Při použití formaldehydového roztoku nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli inaktivace 0,2 g/l; při použití betapropiolaktonu jeho koncentrace nepřesahuje v žádné chvíli inaktivace 0,1 % (V/V).

Před nebo po inaktivačním postupu se monovalentní spojená sklizeň koncentruje a purifikuje vysokoobrátkovým odstřeďováním nebo jinou vhodnou metodou.

Jen taková monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Hemaglutnační antigen. Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s referenčním antigenem 7 ) nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Virová inaktivace. Provedou se zkoušky popsané v odstavci Zkoušky na čistotu.

Konečná várka vakcíny

Odpovídající množství monovalentních spojených sklizní se smíchá do konečné várky vakcíny. K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Zkouška totožnosti

Antigenní specifita se ověřuje při stanovení obsahu.

Zkoušky na čistotu

Jestliže je v některé tekutině zjištěna hemaglutinace, provede se další pasáž na vejcích a zkouška hemaglutinace; nezjistí se žádná hemaglutinace.

Celkové bílkoviny. Nejvýše šestinásobek celkového obsahu hemaglutininu zjištěného ve Stanovení obsahu, ale nejvýše 100 μg bílkoviny na virový kmen v lidské dávce a nejvýše celkem 300 μg bílkoviny v lidské dávce.

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Ovalbumin. Nejvýše 1 μg ovalbuminu v lidské dávce, stanoveno vhodnou metodou s použitím vhodného referenčního přípravku ovalbuminu.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v lidské dávce.

Stanovení obsahu

Uchovávám

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- že vakcína byla připravena na vejcích,

- kmen nebo kmeny chřipkových virů použitých k přípravě vakcíny,

- metoda inaktivace,

- obsah hemaglutininu v mikrogramech na virový kmen na dávku,

- sezóna, v níž je vakcína určena k ochraně.

Vaccinum influenzae inactivatum ex virorum fragmentis praeparatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti chřipce (štěpený virion)

Je to sterilní vodná suspenze kmene nebo kmenů chřipkového viru typu A nebo B nebo směs kmenů obou typů. Virové kmeny se pěstují odděleně v kuřecích embryích, inaktivují se a ošetří tak, že se virové částice rozštěpí bez zmenšení antigenních vlastností antigenů hemaglutininu a neuraminidasy. Určené množství antigenů hemaglutininu každého kmene obsaženého ve vakcíně je 15 μg v dávce, pokud klinická situace nepodporuje použití jiného množství.

Vakcína je slabě opaleskující tekutina.

Výroba

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro humánní imunní séra a vakcíny (2.6.9).

Výběr vakcinačního kmene

Substrát pro pomnožení viru

Virové inokulum

Bakteriální a plísňová kontaminace. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Provede se zkouška na mykoplazmata; použije se 10 ml.

Pomnožování a sklizeň viru

Monovalentní spojená sklizeň

Před nebo po inaktivačním postupu se monovalentní spojená sklizeň koncentruje a purifikuje vysokoobrátkovým odstřeďováním nebo jinou vhodnou metodou. Virové částice se rozštěpí schváleným postupem na subjednotkové složky. Pro každý nový kmen se provede validační zkouška, aby se dokázalo, že monovalentní spojená sklizeň sestává především z rozštěpených virových částic.

Jen taková monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Hemaglutinační antigen. Obsah hemaglutinačního antigenu se stanoví imunodifuzí (2.7.1), porovnáním s referenčním antigenem 8 ) nebo s antigenem kalibrovaným podle referenčního antigenu. Zkouška se provede při 20 °C až 25 °C.

Pro některé vakcíny fyzická forma částic hemaglutininu nedovoluje provést stanovení imunodifuze po inaktivaci viru. Pro tyto vakcíny se provádí stanovení hemaglutininu v monovalentní spojené sklizni před inaktivaci. Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo vhodné zachování hemaglutinačního antigenu, a je použit vhodný traser například pro stanovení obsahu proteinu.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Virová inaktivace. Provedou se zkoušky popsané v odstavci Zkoušky na čistotu.

Chemikálie použité k rozštěpem. V monovalentní spojené sklizni se provádějí zkoušky na chemikálie užité pro rozštěpení, limity schvaluje oprávněná autorita.

Konečná várka vakcíny

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu, na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Zkouška totožnosti

Antigenní specifita se ověřuje při stanovení obsahu.

Zkoušky na čistotu

Jestliže je v některé tekutině zjištěna hemaglutinace, provede se další pasáž na vejcích a zkouška hemaglutinace; nezjistí se žádná hemaglutinace.

Volný formaldehyd. Vyhovuje zkoušce na volný formaldehyd předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Ovalbumin. Nejvýše 1 μg ovalbuminu v lidské dávce, stanoveno vhodnou metodou s použitím vhodného referenčního přípravku ovalbuminu.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 100 m.j. endotoxinu v lidské dávce.

Stanovení obsahu

U některých vakcín není možné kvantitativní stanovení hemaglutinačního antigenu vzhledem k dostupným referenčním přípravkům. Místo toho se provede vhodnými metodami imunologický důkaz hemaglutinačního antigenu a jeho semikvantitativní stanovení.

Uschovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- že vakcína byla připravena na vejcích,

- kmen nebo kmeny chřipkových virů použitých k přípravě vakcíny,

- metoda inaktivace,

- obsah hemaglutininu v mikrogramech na virový kmen na dávku,

- sezóna, v níž je vakcína určena k ochraně.

Vaccinum laryngotracheitidis infectivae aviariae vivum ad pullum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti ptačí infekční laryngotracheitidě pro kuřata

Je to přípravek z vhodného kmene viru ptačí infekční laryngotracheitidy.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Vakcinační virus se pomnoží na chorioalantoidních blanách kuřecích embryí pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo na vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Pokud se použijí buněčné kultury ptačího původu, pocházejí z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2). Vakcína obsahuje vhodné stabilizující látky a lyofilizuje se.

Výběr vakcinačního kmene

Kmen viru by měl prokazatelně odpovídat z hlediska nevratnosti virulence, indexu intratracheální virulence, bezpečnosti a imunogenity pro zvířata, jimž je určen. Pro průkaz bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít tyto zkoušky.

Nevratnost virulence. Kápnutím do oka se podá takové množství vakcinačního viru (např. deset dávek), které umožní maximální získání viru při dále popsaném pasážování na pěti dvoutýdenních vnímavých kuřatech z chovu prostého specifikovaných patogenů. Za 3 až 5 dnů se z mukózy vhodných částí dýchacího ústrojí jednotlivých kuřat připraví suspenze a vytvoří se směsný vzorek. Každému z pěti dalších kuřat stejného věku a původu se kápnutím do oka podá 0,1 ml směsné mukózní suspenze. Tento postup se provede pětkrát. V každé pasáži se potvrdí přítomnost viru. Jestliže se v některé úrovni pasáže virus nezjistí, provede se druhá série pasáží.

Stanoví se dále popsaný index intratracheální virulence použitím nepasážovaného viru a viru, který byl získán z nejvyšší pasáže. Vakcinační virus vyhovuje zkoušce, jestliže nejsou pozorovány známky zvýšení virulence u viru v nejvyšší pasáži ve srovnání s virem nepasážovaným.

Jestliže vakcinační virus nebyl získán v obou sériích pasáží, vyhovuje rovněž této zkoušce.

Index intratracheální virulence. Pro každý zkoušený virus se použije nejméně šedesát desetidenních vnímavých kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů. Kuřata se namátkově rozdělí do tří skupin, které se umístí a obsluhují odděleně. Připraví se dvě desetinásobná sériová ředění suspenze viru o počátečním titru 10 5 EID 50 nebo CCID 50 v 0,2 ml (nebo pro virus nabývající původní vlastnosti po maximálním pasážování, jak je popsáno výše. Jestliže tyto titry nemohou být dosaženy, použijí se nejvyšší dosažitelné titry). Neředěná virová suspenze a dvě ředění viru se přidělí různým skupinám kuřat. Každému kuřeti se podá intratracheálně 0,2 ml suspenze viru v koncentraci příslušející jeho skupině. Kuřata se pozorují 10 dnů a zaznamenává se počet uhynulých. Index intratracheální virulence je představován součtem počtu úhynů ve třech skupinách. Virový kmen je vyhovující, jestliže index intratracheální virulence není vyšší než 20.

Bezpečnost. Zkouška se provádí pro všechny způsoby podání uvedené v označení a na všech kategoriích kuřat, pro které je vakcína určena. U jednotlivých kategorií se použijí kuřata nejnižšího stáří.

Použije se nejméně dvacet vnímavých kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). U brojlerů se může zkouška provést na sérologicky negativních kuřatech, která nejsou SPF, za předpokladu, že jednou bude zkouška provedena na kuřatech jiné kategorie z chovu prostého specifikovaných patogenů. Každému kuřeti se podá vakcinační virus v množství nejméně desetinásobku nejvyššího titru, pravděpodobně obsaženém v jedné vakcinační dávce. Kuřata se pozorují 21 dnů. Vakcinační virus vyhovuje zkoušce, jestliže žádné kuře nemá neobvyklé příznaky nebo neuhyne z příčin, které lze přisoudit vakcinačnímu viru.

Imunogenita. K průkazu imunogenity je vhodná zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti. Zkouška se provádí na kuřatech nejnižší věkové kategorie, pro kterou je vakcína určena.

Zkoušení šarže

Pokud byly zkoušky na viry aviární leukózy a cizí viry na buněčných kulturách a na kuřecích embryích provedeny s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, mohou být tyto zkoušky při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěny, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Rekonstituovaná, a je-li třeba, i naředěná a monospecifickým sérem proti aviární infekční laryngotracheitidě neutralizovaná vakcína již dále neinfikuje chorioalantoidní membránu kuřecích embryí pocházejících z chovu prostých specifikovaných patogenů nebo citlivé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset vnímavých kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2), která mají nejnižší stáří uvedené v označení. Kápnutím do oka se každému kuřeti podá deset dávek vakcíny ve vhodném objemu. Kuřata se pozorují 21 dnů. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže během pozorovací doby uhynou nejvýše dvě kuřata z důvodů, které nelze přisuzovat vakcíně. Uhyne-li více kuřat, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné kuře nemá výrazné klinické příznaky onemocnění nebo neuhyne z příčin, které lze přisoudit vakcíně.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Je-li třeba, vakcína se nejprve naředí a potom neutralizuje monospecifickým sérem proti ptačí infekční laryngotracheitidě. Vyhovuje zkoušce na virus ptačí leukózy.

Cizí viry při použití buněčných kultur (2.6.5). Je-li třeba, vakcína se nejprve naředí a potom neutralizuje monospecifíckým sérem proti ptačí infekční laryngotracheitidě. Vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití buněčných kultur.

Cizí viry při použití kuřecích embryí (2.6.3). Je-li třeba, vakcína se nejprve naředí a potom neutralizuje monospecifíckým sérem proti ptačí infekční laryngotracheitidě. Vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití kuřecích embryí.

Cizí agens při použití kuřat (2.6.6). Vakcína vyhovuje zkoušce na cizí agens při použití kuřat. Vakcína rovněž vyhovuje zkoušce s fluorescenčními protilátkami nebo enzymové imunoanalýze (ELISA) na aviární retikuloendotelový virus a enzymové imunoanalýze (ELISA) na virus krůtí rhinotracheitidy, která se provede ze séra vakcinovaných kuřat.

Bakterie a houby. Provede se kvantitativní zkouška na bakterie a houby. Vakcína může obsahovat pouze jeden saprofytický mikroorganismus v jedné dávce a neobsahuje žádný patogenní mikroorganismus. Vakcíny určené k parenterálnímu podání spolu s příslušnou tekutinou vyhovují zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Rekonstituovaná vakcína se titruje inokulací na chorioalantoidní membránu devítidenních až jedenáctidenních kuřecích embryí nebo na vhodné buněčné kultury. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá nejnižšímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použije se nejméně třicet vnímavých kuřat stejného původu z chovu prostého specifikovaných patogenů. Každému z nejméně dvaceti kuřat se podá jedna dávka vakcíny a nejméně deset kuřat slouží jako kontrola. Za 21 dnů se každé kuře intratracheálně čelenžuje dostatečným množstvím virulentního viru ptačí infekční laryngotracheitidy. Kuřata se pozorují 7 dnů po čelenži. Zaznamenají se úhyny, na konci pozorovací doby se provede postmortální vyšetření na makroskopické léze -- mukózní, hemoragický a pseudomembranózní zánět průdušnice a orbitálních sinů.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejméně 90 % kontrol uhyne nebo vykazuje průkazné makroskopické léze na průdušnici a v orbitálních sinech. V opačném případě se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje, jestliže nejméně 90 % vakcinovaných kuřat přežije a nemá makroskopické léze na průdušnici ani v orbitálních sinech.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum leptospirosis ad usum veterinarium ⟪MEDIA:img_001⟫

Vakcína proti leptospiróze pro veterinární použití

Je to inaktivovaná suspenze jednoho nebo více kmenů Leptospira interrogans sérovar canicola nebo icterohaemorrhagiae či směs obou sérovarů.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Leptospiry se kultivují ve vhodné živné půdě, která může obsahovat sérum. Z konečného výrobku se sérum odstraní. Na konci růstu se mikroorganismy zcela inaktivují fyzikálními nebo chemickými prostředky nebo jejich kombinací. Může se přidat adjuvans a přípravek se může též lyofilizovat.

Následující požadavky platí pro tekuté přípravky a pro lyofilizované přípravky po jejich rekonstituování podle návodu.

Zkouška totožnosti

Když se přípravek podá pokusným zvířatům, vyvolá tvorbu aglutinačních protilátek proti sérovaru nebo sérovarům použitým k jeho přípravě.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě zdravá zvířata toho druhu, pro který je přípravek určen a která jsou vnímavá k sérovaru či sérovarům použitým při výrobě přípravku. Sérum těchto zvířat neobsahuje aglutinační protilátky proti daným sérovarům. Každému zvířeti se doporučeným způsobem vstříkne dvojnásobek předepsané dávky pro psy uvedené v označení. Zvířata se pozorují 14 dní. Neprojeví se žádná výrazná místní ani systémová reakce.

Inaktivace. Zkouška na živé leptospiry se provede naočkováním do specifické živné půdy. Jeden mililitr zkoušeného přípravku se naočkuje do 100 ml živné půdy. Půda se inkubuje 14 dní při 30 °C, poté se vyočkuje do dalšího množství živné půdy a obě půdy se inkubují 14 dní při 30 °C; v žádné půdě se neobjeví růst leptospir. Současně se provede kontrolní zkouška naočkováním zkoušeného přípravku s kulturou leptospir do dalšího množství živné půdy. Inkubuje se 14 dní při 30 °C; během 14 dní se projeví růst leptospir.

Sérum. Pokud se během výroby přípravku použilo sérum, provede se sérum-precipitační zkouška, kterou se prokáže nepřítomnost séra v konečné várce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Pěti křečkům ze stejného chovu nejvýše 3 měsíce starým se podkožně vstříkne po 1/40 dávky uvedené v označení pro psy. Za 15 až 20 dní se intraperitoneálně vstříkne vakcinovaným zvířatům i nevakcinovaným kontrolám, které tvoří 5 křečků ze stejného chovu, v přiměřeném množství virulentní kultura leptospir sérovaru obsaženého ve vakcíně nebo suspenze jaterní či ledvinové tkáně zvířat infikovaných leptospirami shodného sérovaru. Jestliže se použily k výrobě vakcíny L. interrogans sérovar canicola i sérovar icterohaemorrhagiae, provádí se zkouška účinnosti pro každý sérovar zvlášť. Během 14 dní po čelenži uhynou nejméně 4 kontrolní zvířata za příznaků leptospirózy. Vakcinovaná zvířata se pozorují ještě 14 dní po úhynu kontrolních zvířat a nejméně 4 z nich přežijí v dobrém zdraví.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení obalu se uvede:

- sérovar nebo sérovary použité při výrobě,

- zda bylo při výrobě použito sérum.

Vaccinum meningococcale polysaccharidicum ⟪MEDIA:img_001⟫

Polysacharidová vakcína proti meningokokům

Je to lyofilizovaný přípravek jednoho nebo více puntíkovaných kapsulárních polysacharidů získaných z jednoho nebo více vhodných kmenů Neisseria meningitidis skupiny A, C, Y a W 135, které jsou schopny trvale vytvářet polysacharidy.

Polysacharid V. meningitidis skupiny A tvoří opakující se jednotky částečně O-acetylovaného N-acetylmanosaminu spojené 1alfa 6 fosfodiesterovými vazbami.

Polysacharid N. meningitidis skupiny C tvoří opakující se jednotky částečně O-acetylované kyseliny sialové spojené 2alfa 9 glykosidickými vazbami.

Polysacharid N. meningitidis skupiny Y tvoří střídající se jednotky částečně O-acetylované kyseliny sialové a D-glukosy spojené 2alfa 6 a 1alfa 4 glykosidickými vazbami.

Polysacharid V. meningitidis skupiny W 135 tvoří střídající se jednotky částečně O-acetylované kyseliny sialové a D-galaktosy spojené 2alfa 6 a 1alfa 4 glykosidickými vazbami.

Polysacharidová složka nebo složky uvedené v označení na obalu tvoří společně s ionty vápníku a zbytkovou vlhkostí více než 90 % hmotnosti přípravku.

Zkoušený přípravek vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výroba je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní postup prokazatelně poskytuje homogenní přípravek s dostatečnou imunogenitou a bezpečností pro člověka.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že výrobek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a humánních vakcín (2.6.9).

Inokula

Kmeny N. meningitidis použité na matečná inokula se určí podle vývojových záznamů, které obsahují informace o jejich původu a jejich biochemických a sérologických charakteristikách.

Kultury z pracovního inokula mají stejné charakteristiky jako kmen použitý k přípravě matečného inokula. Kmeny mají následující charakteristiky:

- kolonie získané z kultury jsou kruhovité, jednotného tvaru a lesku s mukózním, opalescentním a našedlým vzhledem,

- barvení podle Grama ukazuje charakteristické gramnegativní diplokoky v uspořádání kávových zrn,

- oxidasová zkouška je pozitivní,

- kultury utilizují glukosu a maltosu,

- suspenze kultur jsou vhodnými specifickými antiséry aglutinovány.

Růst a sklizeň

Pracovní inokula se pěstují na pevných půdách neobsahujících substance krevních skupin ani látky savčího původu. Inokulum může pocházet z jedné nebo více subkultivací v tekuté živné půdě před tím, než bylo použito k inokulaci konečné živné půdy. Použité tekuté půdy a konečná živná půda jsou semisyntetické a prosty látek srážených cetrimoniumbromidem (hexadecyltrimethylamoniumbromid) a neobsahují substance krevních skupin ani vysokomolekulární polysacharidy.

Bakteriální čistota kultury se ověřuje mikroskopickým vyšetřením nátěrů barvených podle Grama a naočkováním do vhodných půd; několik polí se pozoruje při velkém zvětšení tak, aby se vyšetřilo nejméně 10 000 organismů.

Kultury se odstředí a z tekutiny se polysacharidy vysrážejí přidáním cetrimoniumbromidu. Získaná sraženina se oddělí a může se uchovávat před další purifikací při -20 °C.

Purifikované polysacharidy

Po rozštěpení komplexu polysacharidů a cetrimoniumbromidu se polysacharidy purifikují za použití vhodných postupů k odstranění zbylých nukleových kyselin, bílkovin a lipopolysacharidů.

Posledním purifikačním stupněm je srážení polysacharidů ethanolem. Ty se potom vysuší a uchovávají při -20 °C. Ztráta sušením se stanoví termogravimetricky (2.2.34) a získaná hodnota se použije k přepočtu jiných chemických výsledků zkoušek na vysušenou látku.

K přípravě konečné várky vakcíny se mohou použít pouze takové purifikované polysacharidy, které vyhovují následujícím požadavkům.

Bílkoviny (2.5.16). Nejvýše 10 mg bílkovin v gramu purifikovaného polysacharidu, přepočteno na vysušenou látku.

Nukleové kyseliny (2.5.17). Nejvýše 10 mg nukleových kyselin v gramu purifikovaného polysacharidu, přepočteno na vysušenou látku.

O-acetyl skupiny (2.5.19). Nejvýše 2 mmol O-acetyl skupin v gramu purifikovaných polysacharidů skupiny A, nejvýše 1,5 mmol v gramu polysacharidů skupiny C, nejvýše 0,3 mmol v gramu polysacharidu skupin Y a W135, to vše přepočteno na vysušenou látku.

Fosfor (2.5.18). Nejvýše 80 mg fosforu v gramu purifikovaného polysacharidu skupiny A, přepočteno na vysušenou látku.

Kyselina sialová (2.5.23). Nejvýše 800 mg kyseliny sialové v gramu polysacharidu skupiny C a nejvýše 560 mg kyseliny sialové v gramu purifikovaného polysacharidu skupiny Y a W135, to vše přepočteno na vysušenou látku. Použijí se tyto porovnávací roztoky:

Polysacharid skupiny C: roztok kyseliny N-acetylneuraminové R (150 mg/l),

Polysacharid skupiny Y: roztok obsahující kyselinu N-acetylneuraminovou R (95 mg/l) a glukosu R (55 mg/l),

Polysacharid skupiny W135: roztok obsahující kyselinu N-acetylneuraminovou (95 mg/l) a galaktosu R (55 mg/l).

Vápník. Jestliže byly při purifikaci použity vápenaté soli, provede se stanovení vápníku, jehož obsah bude v rozmezí schváleném pro výrobek.

Rozdělení velikostí molekul. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30) s použitím agarosy pro chromatografii R nebo agarosy síťované pro chromatografii R. Použije se kolona délky asi 0,9 m a vnitřního průměru 16 mm, jejíž rovnováha byla ustavena rozpouštědlem s iontovou silou 0,2 mol/kg a hodnotou pH 7,0 až 7,5. Na kolonu se nanese 2,5 mg polysacharidu v objemu asi 1,5 ml a eluuje se asi 20 ml/h. Odebírají se frakce asi po 2,5 ml a obsah polysacharidu se stanoví vhodnou metodou.

Před dosažením distribučního koeficientu (KD) 0,50 se eluuje nejméně 65 % polysacharidu skupiny A, 75 % polysacharidu skupiny C, 80 % polysacharidu skupiny Y a 80 % polysacharidu skupiny W135. Mimo to jsou procenta eluovaná před dosažením tohoto distribučního koeficientu v rozmezích schválených pro jednotlivé výrobky.

Totožnost a sérologická specificita. Totožnost a sérologická specificita se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Potvrdí se totožnost a čistota každého polysacharidu a dokáže se, že obsah polysacharidu heterologní skupiny N. meningitidis nepřesahuje 1 %.

Pyrogenní látky (2.6.8). Polysacharid vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne 1 ml roztoku obsahujícího 0,025 μg purifikovaného polysacharidu v mililitru.

Konečná várka vakciny

Jeden nebo více polysacharidů jedné nebo více skupin N. meningitidis se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, které může obsahovat stabilizátor. Když se úplně rozpustí, zfiltruje se roztok filtrem zadržujícím bakterie.

K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakciny, která vyhovuje následujícímu požadavku.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakciny vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou živnou půdu použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakciny se asepticky rozdělí do sterilních obalů. Obaly se pak uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Do spotřeby se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje všem požadavkům, předepsaným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti.

Vlastnosti

Bílý nebo krémově zbarvený prášek nebo tablety snadno rozpustné ve vodě.

Zkouška totožnosti

Každý polysacharid obsažený ve vakcíně se dokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Zkoušky na čistotu

Rozdělení velikosti molekul. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30). Použije se kolona délky asi 0,9 m a vnitřního průměru 16 mm, jejíž rovnováha byla ustavena rozpouštědlem s iontovou silou 0,2 mol/kg a hodnotou pH 7,0 až 7,5. Na kolonu se nanese 2,5 mg polysacharidu v objemu asi 1,5 ml a eluuje se asi 20 ml/h. Odebírají se frakce asi po 2,5 ml a obsah polysacharidu se stanoví vhodnou metodou.

Pro bivalentní vakcínu (skupina A + skupina C) se použije agarosa síťovaná pro chromatografii R Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže:

- 65 % polysacharidu skupiny A se eluuje před K D = 0,50,

- 75 % polysacharidu skupiny C se eluuje před K D = 0,50.

Pro tetravalentní vakcínu (skupina A + skupina C + skupina Y + skupina W135) se použije agarosa síťovaná pro chromatografii R1 a aplikuje se vhodná imunochemická metoda (2.7.1), aby se zajistily eluční podmínky pro různé polysacharidy. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže K D pro hlavní pík je:

- nejvýše 0,70 pro polysacharid skupiny A a skupiny C,

- nejvýše 0,57 pro polysacharid skupiny Y,

- nejvýše 0,68 pro polysacharid skupiny W 135.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne nitrožilně 1 ml roztoku obsahujícího:

- 0,025 μg polysacharidu monovalentní vakcíny,

- 0,050 μg polysacharidu bivalentní vakcíny,

- 0,10 μg polysacharidu tetravalentní vakcíny.

Stanovení obsahu

Provede se stanovení každého polysacharidu obsaženého ve vakcíně.

Pro bivalentní vakcínu (skupina A a skupina C) se použije měření obsahu fosforu (2.5.18) ke stanovení obsahu polysacharidu A a měření obsahu kyseliny sialové (2.5.23) ke stanovení obsahu polysacharidu C. Ke stanovení kyseliny sialové se jako referenční roztok použije roztok kyseliny N-acetylneuraminové R (150 mg/l).

Pro tetravalentní vakcínu (skupina A + skupina C + skupina Y + skupina W 135) se použije vhodná imunochemická metoda (2.7.1) s referenčním přípravkem purifikovaného polysacharidu pro každou skupinu.

Vakcína obsahuje 70 % až 130 % množství každého polysacharidu uvedeného v označení.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- skupina nebo skupiny polysacharidů (A, C, Y nebo W135) obsažené ve vakcíně,

- počet mikrogramů polysacharidu v lidské dávce.

Vaccinum morbi Aujeszkyi ad suem inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti Aujeszkého nemoci prasat

Je to suspenze vhodného kmene viru Aujeszkého nemoci inaktivovaného bez ovlivnění imunogenních vlastností nebo suspenze inaktivované frakce viru mající odpovídající imunogenní vlastnosti.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Virový kmen se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře (5.2.4). Virová suspenze se sklidí a inaktivuje; mohou se připravit částice virů, které se purifikují a koncentrují.

Zkouška na zbylý infekční virus Aujeszkého nemoci se provádí na sklizené várce každé šarže a používá se přitom dvou pasáží na stejném typu buněčné kultury, jaký byl použit při výrobě vakcíny, a tím se potvrdí účinná inaktivace. Množství inaktivovaného viru používaného ve zkoušce odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny. Nezjistí se živý virus. Může se přidat vhodné adjuvans a protimikrobní konzervační látky. Vakcína může být lyofilizovaná.

Výběr vakcinačního kmene

K přípravě vakcíny se může použít jen takový virový kmen, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska bezpečnosti a imunogenity. Mohou se použít následující zkoušky k důkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7).

Bezpečnost.

A. Zkouška se provádí u všech kategorií zvířat, pro které je vakcína určena (prasnice, výkrmová prasata). Použitá zvířata musí být prosta protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Dvě dávky vakcíny se předepsaným způsobem podají nejméně deseti zvířatům. Po 14 dnech se každému zvířeti vstříkne jedna dávka vakcíny a zvířata se pozorují dalších 14 dnů. V průběhu 28 dnů zkoušky nevzniknou žádné abnormální místní či systémové reakce.

B. U zvířat použitých ve zkoušce imunogenity se také hodnotí bezpečnost kmene. U každého vakcinovaného zvířete se měří rektální teplota v době vakcinace, za 24 h a 48 h po ní. Nezjistí se signifikantní vliv na tělesnou teplotu, ani jiné systémové reakce (např. anorexie). Při porážce se místo podání vyšetří na místní reakci. Nevzniknou významné místní reakce.

C. Zvířata používaná na terénní zkoušky se také používají k hodnocení bezpečnosti. Použitá zvířata nemají protilátky proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Zkouška se provádí u všech kategorií zvířat, pro které je vakcína určena (prasnice, výkrmová prasata). Vytvoří se nejméně tři skupiny o dvaceti zvířatech s odpovídajícími kontrolními skupinami o nejméně deseti zvířatech. Tělesná teplota se měří všem zvířatům v době vakcinace, 24 h a 48 h po vakcinaci. Nezjistí se významný vliv na tělesnou teplotu. Při porážce se místo podání vyšetří na místní reakci. Nevzniknou významné místní reakce.

Imunogenita. Použije se nejméně deset výkrmových prasat ve stáří vhodném k vakcinaci prostých protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo frakcím viru. Tělesná hmotnost prasat se neliší od průměru skupiny o více než 20 %. Každé prase se očkuje podle doporučeného schématu a doporučeným způsobem. Pět podobných prasat se ponechá jako kontrola. Na konci výkrmového období (80 kg až 100 kg) se každé prase zváží a provede se čelenž intranazálním podáním vhodného množství virulentního kmene viru Aujeszkého nemoci. Každé zvíře se zváží 7 dní po čelenži, nebo v době úhynu, jestliže k němu dojde dříve, a dosažený denní průměr se vypočítá v procentech. Pro každou skupinu (vakcinovanou i kontrolu) se vypočítá průměr z denních průměrných přírůstků. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže vakcinovaná prasata přežijí a rozdíl mezi denními průměrnými přírůstky v obou skupinách je nejméně 1,5. Zkoušku lze hodnotit jedině v případě, jestliže všechna kontrolní prasata mají příznaky onemocnění Aujeszkého nemocí a průměr jejich denních přírůstků je méně než -0,5.

Jestliže je vakcína určena pro prasnice k pasivní ochraně selat, může se vhodnost kmene pro tento účel prokázat následující metodou. Osm prasnic bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci se vakcinuje podle doporučeného schématu a doporučeným způsobem; čtyři prasnice se ponechají jako kontrola. Selata od těchto prasnic se ve stáří 7 dní čelenžují vhodným množstvím virulentního kmene viru Aujeszkého nemoci. Selata se pozorují 21 dní. Vakcína je vyhovující, jestliže u selat od vakcinovaných prasnic je nejméně 80% ochrana před úhynem v porovnání s kontrolní skupinou. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže každý vrh má nejméně osm selat.

Zkoušení šarže

Jestliže se s uspokojivým výsledkem provedla zkouška účinnosti na prasatech s reprezentativní šarží vakcíny, ale s použitím skupin o deseti prasatech místo pěti, může se tato zkouška u výrobce po schválení oprávněnou autoritou nahradit jako běžná zkouška jiných šarží vakcíny připravených ze stejného inokula alternativní zkouškou, pro kterou byla dostatečná korelace výsledků s lékopisnou metodou potvrzena statistickým hodnocením.

Zkouška totožnosti

U zvířat bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci zkoušený přípravek povzbudí tvorbu specifických protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci použité pro výrobu vakcíny.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Nejméně třem selatům v minimálním stáří pro vakcinaci se vstříknou dvě dávky vakcíny předepsaným způsobem. Zvířata jsou bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Zvířata se pozorují 14 dní a potom se každému vstříkne jedna dávka vakcíny. Pozoruj í se dalších 14 dní. V průběhu 28 dní zkoušky se nezjistí abnormální místní nebo systémové reakce.

Inaktivace. Pokud možno, provede se vhodná zkouška na zbylý infekční virus Aujeszkého nemoci s použitím dvou pasáží na stejné buněčné kultuře, jaká byla použita při přípravě vakcíny. Jinak se vstříkne po jedné dávce vakcíny podkožně pěti králíkům, kteří se pozorují 14 dní po podání. Nezjistí se výzkyt abnormálních reakcí (zejména místní vyrážka). Jestliže vakcinační virus není patogenní pro králíky, provede se zkouška na dvou ovcích.

Cizí virus. U selat použitých pro zkoušku bezpečnosti se provede zkouška na protilátky. Vakcína nepodporuje tvorbu protilátek proti jinému viru než proti viru Aujeszkého nemoci, proti virům patogenním pro prasata nebo proti virům, které by mohly překážet diagnóze infekčních onemocnění prasat (včetně virů ze skupiny pestivirů).

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Použije se nejméně pět prasat o hmotnosti 15 kg až 35 kg prostých protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Živá hmotnost žádného z prasat se neliší o více než 25 % od průměrné hmotnosti ve skupině. Každému praseti se podá předepsaným způsobem jedna dávka vakcíny. Pět podobných prasat se použije jako kontrola. Za tři týdny se prasata jednotlivě zváží a provede se intranazálně čelenž vhodným množstvím virulentního kmene viru Aujeszkého nemoci. Každé zvíře se zváží 7 dní po čelenži nebo v době úhynu, jestliže k němu dochází dříve, a vypočítá se průměrný denní přírůstek v procentech. Pro každou skupinu (vakcinovanou i kontrolní) se vypočítá průměrný denní přírůstek v procentech. Vakcína vyhovuje, jestliže vakcinovaná prasata přežijí a rozdíly mezi průměry denních přírůstků v obou skupinách jsou nejméně 1,1. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže všechna kontrolní prasata mají příznaky Aujeszkého nemoci a průměr jejich denních přírůstků dosahuje méně než -0,5.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- zda je vakcinační kmen patogenní pro králíky,

- zda je vakcína z celého viru nebo subjednotková.

Vaccinum morbi Aujeszkyi ad suem vivum cryodesiccatum ad usum parenterale ⟪MEDIA:img_001⟫

Lyofilizovaná živá vakcína proti Aujeszkého nemoci prasat pro parenterální podání

Je to přípravek z oslabeného kmene viru Aujeszkého nemoci. Může se podávat po smíchání s adjuvans.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virový kmen se pěstuje na vnímavé buněčné kultuře (5.2.4) nebo na kuřecích embryích z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2). Virová suspenze se sklidí, smíchá s vhodnou stabilizující tekutinou a lyofilizuje se.

Výběr vakcinačního kmene

K přípravě vakcíny se může použít pouze takový virový kmen, který prokazatelně odpovídá následující charakteristice: bezpečný; přenosný včetně přechodu přes placentu a přenosný semenem; nevratně oslabený a imunogenní. Kmen může mít genetické markery. K průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky:

Bezpečnost.

A. Deseti selatům ve stáří 3 až 4 týdny, které nemají protilátky proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci, se určeným způsobem podá množství viru, které odpovídá deseti dávkám vakcíny. Deset selat z téhož zdroje a stejného stáří, které nemají protilátky proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci, se ponechá jako kontrola. Zvířata se pozorují po dobu 21 dní. Zvířata zůstávaj í zdravá a křivka hmotnosti vakcinovaných selat se neliší od křivky selat kontrolních.

B. U zvířat použitých ve zkoušce na imunogenity se také hodnotí bezpečnost kmene. Rektální teplota se u každého vakcinovaného zvířete měří v době vakcinace, za 24 h a 48 h po ní. Nezjistí se signifikantní vliv na tělesnou teplotu, ani jiné systémové reakce (např. anorexie). Při porážce se místo podání vyšetří na místní reakci. Nevzniknou významné místní reakce.

D. Deseti selatům ve stáří 3 až 5 dní, která jsou prosta protilátek viru proti Aujeszkého nemoci nebo jeho frakcím, se intranazálně podá množství viru, které odpovídá deseti dávkám vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Žádné sele neuhyne ani se neprojeví neurologické poruchy, jež by se mohly přisoudit vakcinačnímu viru.

E. Pěti selatům ve stáří 3 až 5 dnů se intracerebrálně vstříkne jedna dávka vakcíny. Žádné sele neuhyne ani se neobjeví neurologické poruchy.

F. Pět dní se denně deseti selatům ve stáří 3 až 4 týdny bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci podávají 2 mg prednisolonu na kilogram tělesné hmotnosti. Třetí den se každému seleti určeným způsobem podá takové množství viru, které odpovídá jedné dávce vakcíny. Protimikrobní látky se mohou podat, aby se předešlo nespecifickým příznakům. Zvířata se pozorují 21 dní po podání viru. Selata zůstávají zdravá.

G. Použije se patnáct březích prasnic bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Pěti prasnicím se určeným způsobem podá množství viru, které odpovídá deseti dávkám vakcíny, ve 4. až 5. týdnu březosti. Dalším pěti prasnicím se stejným způsobem podá stejné množství viru v 10. až 11. týdnu březosti. Dalších pět březích prasnic se použije jako kontrola. Počet narozených selat od vakcinovaných prasnic, jakékoliv abnormality u selat a délka březosti se významně neliší od prasnic kontrolních. Od selat narozených od vakcinovaných prasnic se neizoluje virus Aujeszkého nemoci, ani se nezjistí protilátky proti viru Aujeszkého nemoci před napitím kolostra.

Šíření v těle. Použije se osmnáct prasat ve stáří 3 až 4 týdny bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Čtrnácti prasatům se podá jedna dávka vakcíny doporučeným způsobem na doporučené místo. Skupiny po dvou vakcinovaných prasatech se porážejí za 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h a 120 h po vakcinaci. Zbývající dvě skupiny po dvou prasatech slouží jako kontrola a porazí se za 6 h a 120 h. Provedou se odděleně vhodné citlivé zkoušky na virus z následujících tkání a sekretů: tonzily, nosní sliznice, plíce, aplikační místo, satelitní lymfatické uzliny, slezina, mozková tkáň, výkaly a sliny. Vakcína je přijatelná, pokud virus není zjištěn v sekretech, výkalech, nosní sliznici, plicích a mozkové tkáni.

Infekčnost. Zkouška se provede čtyřikrát nezávisle na sobě. Pokaždé se použijí čtyři selata ve stáří 3 až 4 týdny bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Každému seleti se určeným způsobem podá množství viru odpovídající jedné dávce vakcíny. Jeden den po podání vakcíny se do těsné blízkosti vakcinovaných selat dají selata nevakcinovaná stejného stáří a bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Za pět týdnů se všechna zvířata testuj í na přítomnost protilátek proti viru Aujeszkého nemoci. Protilátky proti viru Aujeszkého nemoci se nezjistí v žádné skupině kontaktních kontrol. U všech naočkovaných selat se protilátky prokážou.

Nevratnost oslabení. Dvěma selatům ve stáří 3 až 5 dní, která nemají protilátky proti viru Aujeszkého nemoci ani frakci viru, se intranazálně podá množství viru, které odpovídá jedné dávce vakcíny. Za tři až pět dnů se odeberou od každého selete vzorky mozku, plic, tonzil a místních lymfatických uzlin a vzorky se smíchají. Jeden mililitr smíchané orgánové suspenze se podá intranazálně dalším dvěma selatům stejného stáří a vnímavosti. Tato operace se opakuje nejméně devětkrát, naposledy na nejméně pěti selatech. Přítomnost viru se ověřuje v každé pasáži přímým nebo nepřímým způsobem. Jestliže virus zmizí, provede se druhá série pasáží. Selata nehynou a ani nevykazují neurologické poruchy, jež by se mohly přičíst vakcinačnímu viru. V porovnání s nepasážovaným virem nejsou známky zvýšení virulence.

Imunogenita. Použije se nejméně deset výkrmových prasat ve stáří doporučeném k vakcinaci, která jsou prosta protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Tělesná hmotnost se u prasat neliší od průměrné hmotnosti skupiny o více než 20 %. Každé prase se vakcinuje podle doporučeného schématu a doporučeným způsobem. Pět podobných prasat se použije jako kontrola. Na konci výkrmového období (80 kg až 100 kg) se prasata zváží a provede se čelenž intranazálním podáním vhodného virulentního kmene viru Aujeszkého nemoci. Každé zvíře se 7 dní po čelenži nebo v době úhynu, jestliže k němu dojde dříve, zváží a vypočítá se denní průměrný přírůstek v procentech. Pro každou skupinu (vakcinovanou i kontrolu) se vypočítá průměr z denních průměrných přírůstků. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže všechna vakcinovaná prasata přežijí a rozdíl mezi průměry denních přírůstků obou skupin je nejméně 1,5. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže všechna kontrolní prasata vykazují příznaky onemocnění Aujeszkého nemoci a průměr jejich denních přírůstků je méně než -0,5.

Jestliže je vakcína určena k použití u prasnic k pasivní ochraně selat, může se vhodnost kmene pro tento účel prokázat následující metodou. Osm prasnic prostých protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci se vakcinuje podle doporučeného schématu a doporučeným způsobem; čtyři prasnice se použijí jako kontrola. Selata od těchto prasnic se čelenžují vhodným množstvím virulentního viru Aujeszkého nemoci ve věku 7 dní a pozorují se 21 dní. Vakcína je uspokojivá, jestliže selata od vakcinovaných prasnic jsou v porovnání s kontrolní skupinou nejméně z 80 % chráněna oproti mortalitě. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže každý vrh selat má nejméně osm selat.

Zkoušení šarže

Jestliže byla zkouška na účinnost u prasat provedena s vyhovujícím výsledkem u reprezentativní dávky vakcíny, pak tato zkouška za souhlasu oprávněné autority může být opomenuta výrobcem při provádění pravidelné kontroly u dalších šarží vakcíny připravených z téhož inokula.

Zkouška totožnosti

U zvířat bez protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo frakcím viru zkoušený přípravek povzbudí tvorbu specifických neutralizujících protilátek.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Deset dávek vakcíny se podá způsobem uvedeným v označení nejméně třem selatům ve stáří 3 až 4 týdny, která jsou prostá protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Tři selata stejného stáří prosta protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci se použijí jako kontrola. Zvířata se pozorují 14 dní. Nezjistí se abnormální místní nebo systémové reakce. Křivka hmotnosti vakcinovaných selat se neliší od křivky selat kontrolních.

Cizí viry. Vakcína se neutralizuje monospecifickým antisérem a naočkuje se na buněčnou kulturu vnímavou k viru patogennímu pro prasata. Kultura se udržuje 14 dní a v průběhu této doby se provede nejméně jedna pasáž. Nevyvíjí se cytopatický efekt; buňky nevykazují přítomnost hemadsorpčního agens; tekutina z kultury je prosta hemaglutinačních agens.

U selat použitých pro zkoušku bezpečnosti se provede zkouška na protilátky proti virům ze skupiny pestivirů. Vakcína nevyvolá tvorbu takových protilátek.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Titr viru. Rekonstituovaná vakcína se titruje na buněčné kultuře nebo inokulací do alantoidní dutiny kuřecích embryí. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá minimálnímu titru viru, který je uveden v označení.

Stanovení účinnosti

Zkouška účinnosti se provede každým způsobem podání, který je uveden v označení. Použij e se nejméně pět prasat o hmotnosti 15 kg až 35 kg prostých protilátek proti viru Aujeszkého nemoci nebo jeho frakci. Hmotnost žádného prasete se neliší o více než 25 % od průměrné hmotnosti ve skupině. Každému praseti se podá způsobem uvedeným v označení jedna dávka vakcíny. Pět podobných prasat se použije jako kontrola. Za tři týdny se provede u každého prasete intranazálně čelenž vhodným množstvím virulentního kmene viru Aujeszkého nemoci. Každé zvíře se zváží 7 dní po čelenži nebo v době úhynu, jestliže k němu dojde dříve, a vypočítá se průměrný denní přírůstek v procentech. Pro každou skupinu (vakcinovanou i kontrolní) se vypočítá průměr denních průměrných přírůstků. Vakcína vyhovuje, jestliže vakcinovaná prasata přežijí a rozdíl mezi průměry denních přírůstků v skupinách není menší než 1,6. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže všechna kontrolní prasata mají příznaky onemocnění Aujeszkého nemoci a průměr jejich denních přírůstků je méně než -0,5.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum morbi Carrei vivum cryodesiccatum pro cane ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti psince lyofilizovaná

Je to přípravek z kmene viru psinky, který je oslaben pro psy.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Oslabený kmen se pomnoží ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4) nebo kuřecích embryích získaných ze zdravých chovů (5.2.2).

Výběr vakcinačního kmene

Pouze virový kmen prokazatelně odpovídající z hlediska oslabení a imunogenity se může použít k přípravě vakcíny. K průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Oslabení. Objem virové suspenze odpovídající polovině dávky vakcíny, nebo jestliže tento objem obsahuje méně než 500 CCID 50 nebo 500 EID 50 , množství, které obsahuje 500 CCID 50 , či 500 EID 50 , se intracerebrálně vstříkne každému ze dvou vnímavých štěňat ve stáří 8 až 16 týdnů. Během 21 dní tato dávka nevyvolává patogenní efekt.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity virového kmene.

Zkoušení šarže

Pokud je stanovení účinnosti provedeno s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží připravených z téhož inokula vypuštěna, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Vakcína rekonstituovaná podle pokynů v označení a smíchaná s monospecifíckým psinkovým antisérem nevyvolá již cytopatický efekt ve vnímavé buněčné kultuře nebo poškození chorioalantoidní membrány kuřecích embryí starých 9 dní až 11 dní.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým štěňatům starým 8 až 16 týdnů a prostým psinkových virusneutralizačních protilátek se vstříkne po dvojnásobku dávky rekonstituované vakcíny způsobem uvedeným v označení. Zvířata se pozorují 21 dní. Zvířata zůstávají zdravá bez významných místních či systémových reakcí.

Cizí viry.

A. Rekonstituovaná vakcína se smíchá s monospecifíckým psinkových antisérem. Na vnímavé buněčné kultuře nevyvolá cytopatický efekt, ani nejeví známky přítomnosti hemaglutinačních nebo hemadsorpčních agens.

B. Zkouška se provede na myších hmotnosti 11 g až 15 g. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml rekonstituované vakcíny. Použije se nejméně deset myší, avšak takový počet, který umožní podat 3/10 dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Pokud uhyne více než dvě myši během prvních 48 h, zkouška se opakuje. Od třetího do dvacátého prvního dne od podání nevykazují myši abnormality, které by bylo možné přisoudit vakcíně.

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Titr rekonstituované vakcíny se stanoví na vhodných buněčných kulturách nebo kuřecích embryích 9 dní až 11 dní starých. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně množství viru odpovídající minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použije se sedm vnímavých štěnat 8 až 16 týdnů starých prostých psinkových virusneutralizačních protilátek. Způsobem uvedeným v označení se každému z pěti zvířat podá objem rekonstituované vakcíny obsahující množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení. Další dvě zvířata se ponechají jako kontrola. Všechna zvířata se pozorují 21 dní. Po uplynutí této doby se všem zvířatům intravenózně vstříkne takové množství psinkového viru, které je schopné vyvolat u vnímavých psů onemocnění s typickými příznaky nebo úhyn. Zvířata se pozorují dalších 21 dní. Zvířata vakcinovaná zůstávají zdravá bez příznaků onemocnění. Kontrolní zvířata uhynou na psinku nebo se projeví typické příznaky vážného infekčního onemocnění. Jestliže jedno z kontrolních štěňat nemá žádné příznaky onemocnění, zkouška se opakuje.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum morbi Carrei vivum cryodesiccatum pro mustelidis ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti psince lasičkovitých lyofílizovaná

Je to přípravek z kmene viru psinky, který je oslaben pro fretky.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Oslabený kmen se pomnoží ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4) nebo kuřecích embryích, v obou případech získaných od zdravých zvířat.

Výběr vakcinačního kmene

Oslabení. Když se objem virové suspenze odpovídající pěti dávkám vakcíny intramuskulárně vstříkne každé ze dvou vnímavých fretek, nevyvolá během 21 dní patogenní efekty.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity virového kmene.

Zkoušení šarže

Zkouška totožnosti

Vakcína rekonstituovaná podle pokynů v označení a smíchaná s psinkovým antisérem nevyvolá již cytopatické efekty ve vnímavých buněčných kulturách nebo poškození chorioalantoidních membrán kuřecích embryí starých 9 dní až 11 dní.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým fretkám prostým psinkových virusneutralizačních protilátek se vstříkne po dvojnásobku dávky rekonstituované vakcíny způsobem uvedeným v označení. Zvířata se pozorují 21 dní. Zvířata zůstávají zdravá bez významných místních či systémových reakcí.

Cizí viry.

A. Rekonstituovaná vakcína se smíchá s monospecifickým antisérem. Na vnímavých buněčných kulturách již nevyvolá cytopatický efekt ani nejeví známky přítomnosti hemaglutinačních a hemadsorpčních agens.

B. Zkouška se provede na myších hmotnosti 11 g až 15 g. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml rekonstituované vakcíny. Použije se nejméně deset myší, avšak takový počet, který umožní podat 3/10 dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Pokud uhyne více než dvě myši během prvních 48 h, zkouška se opakuje. Od třetího do dvacátého prvního dne od podání nemají myši abnormality, které by bylo možné přisoudit vakcíně.

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Stanovení účinnosti

Použije se sedm vnímavých fretek prostých psinkových virusneutralizačních protilátek. Způsobem uvedeným v označení se každému z pěti zvířat podá objem rekonstituované vakcíny obsahující množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení. Další dvě zvířata se ponechají jako kontrola. Všechna zvířata se pozorují 21 dní. Po uplynutí této doby se všem zvířatům intramuskulárně vstříkne takové množství psinkového viru, které je schopné vyvolat u vnímavých fretek úhyn. Zvířata se pozorují dalších 21 dní. Zvířata vakcinovaná zůstávají zdravá a kontrolní zvířata uhynou na psinku. Jestliže jedna z kontrol přežije, zkouška se opakuje.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum morbi Marek vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti Markově chorobě

Je to lyofilizovaný nebo tekutý přípravek oslabeného kmene viru Markovy choroby nebo kmene herpesviru izolovaného z krůt.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Kmen viru se pomnožuje ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Pokud jsou buněčné kultury ptačího původu, jsou získány z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2).

Suspenze viru se sklidí a smíchá s vhodnou stabilizační tekutinou. Vakcína se může lyofilizovat.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu vakcíny se může použít pouze kmen viru prokazatelně splňující podmínky nezvratnosti oslabení, bezpečnosti a imunogenity pro zvířata, jimž je vakcína určena. K průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Nevratnost oslabení (pouze u vakcín založených na oslabeném kmenu viru Markovy choroby). Každému z pěti jednodenních kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) se intramuskulárně vstříkne množství viru, které odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Po sedmi dnech se od každého kuřete odeberou bílé krvinky a připraví se směsný vzorek. 1 ml směsného vzorku bílých krvinek se intraperitoneálně vstříkne každému z pěti dalších kuřat téhož věku a vnímavosti. Tento postup se opakuje šestkrát. V každé pasáži se ověří přítomnost viru. Jestliže není virus nalezen, provede se druhá série pasáží. Provede se zkouška bezpečnosti popsaná dále, ve které se použije šestá pasáž viru nebo virus nejvyšší pasáže, ze které byl získán, a nepasážovaný virus. Oba vyhovují zkoušce. Nejsou známky zvýšení virulence pasážovaného viru v porovnání s nepasážovaným virem; k tomu kromě kritérií zkoušky bezpečnosti stanovenými níže není ani významný rozdíl v mikroskopických změnách v brachiálním i ischiadickém plexu a gonádách u ptáků, kteří dostali pasážovaný virus, a u ptáků, kteří dostali virus nepasážovaný.

Bezpečnost. Použije se nejméně 120 geneticky vnímavých jednodenních kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2), která se rozdělí náhodně do tří skupin odděleně chovaných a ošetřovaných. Všechna kuřata, která uhynou v průběhu zkoušky, se pitvají na přítomnost makroskopických změn v důsledku Markovy choroby a na ostatní příčiny úhynu.

Skupina 1: Vhodným způsobem se podá takové množství viru Markovy choroby, které způsobí v průběhu 70 dnů pitvou zjistitelné makroskopické změny Markovy choroby u nejméně 70 % skutečného počtu kuřat.

Skupina 2: Zamýšleným způsobem podání se podá každému kuřeti množství vakcinačního viru, které odpovídá deseti dávkám vakcíny.

Skupina 3: Neošetřované kontroly.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže:

a) v prvních 7 dnech zkoušky neuhyne v žádné skupině více než 10 % kuřat,

b) nejméně 70 % skutečného počtu (výchozí počet snížený o počet těch, která uhynula v průběhu prvních 7 dnů zkoušky) ve skupině 1 má makroskopické změny Markovy choroby,

c) nejméně 80 % kuřat ve skupině 3 přežije 120 dnů a žádné nemá makroskopické změny Markovy choroby nebo protilátky proti viru Markovy choroby.

Vakcinační virus vyhovuje zkoušce:

a) jestliže kuřata 2. skupiny nemají makroskopické změny Markovy choroby,

b) jestliže počet přežívajících kuřat v 2. skupině ve 120 dnech stáří je nejméně 90 % přežívajících v 3. skupině.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity kmene.

Zkoušení šarže

Pokud byly zkoušky na viry ptačí leukózy a na cizí viry na buněčných kulturách a na kuřecích embryích provedeny s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, mohou být tyto zkoušky při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěny, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Totožnost vakcíny se zjišťuje imunofluorescenční zkouškou ve vnímavých buněčných kulturách za použití monoklonální protilátky.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset geneticky vnímavých jednodenních kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Způsobem uvedeným v označení se podá každému kuřeti deset dávek vakcíny, v případě potřeby rekonstituované. Kuřata se pozorují 42 dnů. Pitvají se všechna kuřata, která uhynou, a všechna přežívající, která jsou utracena po 42 dnech. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže žádné z kuřat nemá klinické příznaky, neuhyne, ani při pitvě nevykazuje makroskopické změny přisuzovatelné vakcíně. Zkoušku nelze hodnotit a musí být opakována, pokud v průběhu pozorování více než dvě kuřata uhynou z příčin, které nejsou přisuzovatelné vakcíně.

Důkaz cizích virů na kuřecích embryích (2.6.3). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry užívající kuřecí ambrya.

Důkaz cizích virů na buněčných kulturách (2.6.5). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry užívající buněčné kultury.

Důkaz cizích agens na kuřatech (2.6.6). Vakcína vyhovuje zkoušce na cizí agens provedené na kuřatech. Provede se imunofluorescenční zkouška nebo ELISA test na virus ptačí retikuloendoteliózy se séry vakcinovaných kuřat. Výsledek je negativní.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na viry ptačí leukózy.

Bakterie a houby. Vakcína, je-li třeba rekonstituovaná, vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína, je-li třeba rekonstituovaná, vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Vakcína, je-li třeba rekonstituovaná, se titruje v buněčných kulturách. Jestliže je titr vyjadřován v PFU, stanoví se počet plaků pozorováním charakteristického cytopatického efektu, přičemž se v úvahu berou pouze primární plaky. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru odpovídající minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá jednodenní kuřata z jednoho chovu, který je prost specifikovaných patogenů. Každému z nejméně třiceti kuřat pro každý uvedený způsob podání se podá takový objem vakcíny, je-li třeba rekonstituované, který obsahuje množství viru odpovídající minimálnímu titru viru uvedenému v označení. Jako kontrola slouží třicet kuřat. Po 9 dnech se čelenžuje každé kuře vhodným způsobem dostatečným množstvím virulentního viru Markovy choroby. Zvířata se pozorují nejméně 70 dnů. Úhyny se zaznamenávají a provedou se pitvy na specifické makroskopické změny Markovy choroby. Na konci období pozorování se přežívající zvířata utratí a provedou se pitvy na specifické makroskopické změny Markovy choroby. Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud u každého stanoveného způsobu podání je celkový počet vakcinovaných zvířat vykazujících specifické makroskopické změny snížen nejméně o 80 % ve srovnání s kontrolní skupinou a jestliže čelenžní virus vyvolá specifické makroskopické změny u nejméně 70 % kontrol.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení se uvede:

- stáří zvířat, která mají být vakcinována,

- sérotyp(y) vakcinačního viru.

Vaccinum morbillorum, parotitidis et rubellae vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti spalničkám, příušnicím a zarděnkám

Je to lyofilizovaný přípravek z vhodných oslabených kmenů virů spalniček, příušnic a zarděnek. Vakcína se podle údajů v označení rekonstituuje bezprostředně před použitím; vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Výroba

Tři složky vakcíny se připravují, jak je popsáno v článcích Vaccinum morbilorum (vivum), Vaccinum parotitidis (vivum) a Vaccinum rubellae (vivum), a vyhovují požadavkům v nich předepsaným.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a humánních vakcín (2.6.9).

Konečná várka vakcíny

Sklizně každé virové složky se spojí a vyčeří k odstranění buněk. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se vhodným způsobem naředí. Vhodná množství spojených sklizní jednotlivých složek se smíchají.

Pouze konečná várka, která vyhovuje následujícímu požadavku, se může použít pro přípravu šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu; na každou půdu se použije 10 ml (2.6.1).

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje následujícím požadavkům na teplotní stabilitu a všem požadavkům uvedeným ve Zkouškách totožnosti, Zkouškách na čistotu a ve Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití. Pokud byly zkoušky na bovinní sérumalbumin a případně ovalbumin provedeny s uspokojivými výsledky v konečné várce vakcíny, mohou se u šarže vynechat.

Teplotní stabilita. Zrychlená zkouška stability se provede inkubací lyofilizovaného přípravku na 37 °C po 7 dní. Pokud není jinak vysvětleno a schváleno, je po této době:

- koncentrace viru spalniček nižší nejvýše o 1 log 10 od počáteční hodnoty a hodnota titruje nejméně 1 . 10 3 CCID 50 v jednotlivé lidské dávce,

- koncentrace viru příušnic nižší nejvýše o 1 log 10 od počáteční hodnoty a hodnota titruje nejméně 5 . 10 3 CCID 50 v jednotlivé lidské dávce,

- koncentrace viru zarděnek nižší nejvýše o 1 log 10 od počáteční hodnoty a hodnota titru je nejméně 1 . 10 3 CCID 50 v jednotlivé lidské dávce.

Zkoušky totožnosti

Když se přípravek rekonstituuje tak, jak je uvedeno v označení, a smíchá se specifickými protilátkami pro virus spalniček, příušnic a zarděnek, není schopen infikovat buněčné kultury vnímavé k těmto virům. Když se přípravek rekonstituuje, jak je uvedeno v označení, a smíchá se s množstvím specifických protilátek postačujícím k neutralizaci dvou virových složek, třetí virová složka infikuje vnímavou buněčnou kulturu.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jednotlivé lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Ovalbumin. Je-li příušnicová složka připravena na kuřecích embryích, obsahuje vakcína nejvýše 1 μg ovalbuminu v jednotlivé lidské dávce. Stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3 %.

Stanovení účinnosti

A. Přípravek se smíchá s postačujícím množstvím specifických protilátek proti viru příušnic a s postačujícím množstvím specifických protilátek proti viru zarděnek. Infekční virus spalniček se titruje nejméně trojmo na pěti buněčných kulturách pro každé ředění v řadě pro 0,5 log 10 nebo metodou o stejné přesnosti. K validaci každé zkoušky se použije vhodný referenční virový přípravek. Stanovená koncentrace viru spalniček není nižší než množství uvedené v označení; minimální koncentrace viru spalniček v označení je nejméně 1 . 10 3 CCID 50 v jednotlivé lidské dávce. Zkouška není platná, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) logaritmu virové koncentrace je větší než ±0,3.

B. Přípravek se smíchá s postačujícím množstvím specifických protilátek proti viru spalniček a s postačujícím množstvím specifických protilátek proti viru zarděnek. Infekční virus příušnic se titruje nejméně trojmo na pěti buněčných kulturách pro každé ředění v řadě po 0,5 log 10 nebo metodou o stejné přesnosti. K validaci každé zkoušky se použije vhodný referenční virový přípravek. Stanovená koncentrace viru příušnic není nižší než množství uvedené v označení; minimální koncentrace viru příušnic v označení je nejméně 5 . 10 3 CCID 50 v jednotlivé lidské dávce. Zkouška není platná, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) logaritmu virové koncentra ce je větší než ±0,3.

C. Přípravek se smíchá s postačujícím množstvím specifických protilátek proti viru spalniček a s postačujícím množstvím specifických protilátek proti viru příušnic. Infekční virus zarděnek se titruje nejméně trojmo na pěti buněčných kulturách pro každé ředění v řadě po 0,5 log 10 nebo metodou o stejné přesnosti. K validaci každé zkoušky se použije vhodný referenční virový přípravek. Stanovená koncentrace viru zarděnek není nižší než množství uvedené v označení; minimální koncentrace viru zarděnek v označení je nejméně 1 . 10 3 CCID 50 v jednotlivé lidské dávce. Zkouška není platná, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) logaritmu virové koncentrace je větší než ±0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- kmeny virů použité k přípravě vakcíny,

- zda byla při přípravě vakcíny použita kuřecí embrya,

- typ a původ buněk použitých k přípravě vakcíny,

- minimální koncentrace každé virové složky,

- varování před stykem s dezinfekčními prostředky,

- v jaké době po rekonstituci je třeba vakcínu použít,

- že se vakcína nepodává těhotným ženám a že ženy po vakcinaci nemají po dobu 2 měsíců otěhotnět.

Vaccinum morbillorum vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti spalničkám

Synonymum. Očkovací látka proti spalničkám

Je to lyofilizovaný přípravek ze schváleného oslabeného kmene spalničkového viru. Vakcína se rekonstituuje bezprostředně před použitím, jak je uvedeno v označení. Vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace viru, a je-li virus pomnožován v lidských diploidních buňkách, na systému buněčné banky. Výrobní postup prokazatelně poskytuj e stále stejnou živou spalničkovou vakcínu přiměřené imunogenity a bezpečnosti pro člověka. Pokud není určeno a schváleno jinak, neprojde virus v konečném přípravku od matečného inokula více pasážemi než virus, který byl použit k přípravě vakcíny, která v klinické studii prokázala, že je uspokojivá z hlediska bezpečnosti a účinnosti; ani se schválenými výjimkami počet pasáží nad úroveň použitou pro klinické studie nepřesahuje počet pěti. Klinická studie je zaměřena na neškodnost a účinnost vakcíny.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3) nebo v kulturách buněk z kuřecích embryí pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Virové inokulum

Kmen užitého spalničkového viru je určen podle původních záznamů, které obsahují informaci o jeho původu a o následné manipulaci s ním. Aby se předešlo nadměrnému používání opic ve zkoušce na neurovirulenci, připraví se virové inokulum ve velkém množství a uchovává se lyofilizované při teplotách nižších než -20 C nebo, pokud není lyofilizované, nižších než -60 C.

Pouze virové inokulum vyhovující následujícím požadavkům se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. V matečných a pracovních inokulech se prokáže spalničkový virus séroneutralizační zkouškou v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Koncentrace viru v matečných a pracovních inokulech se stanoví pro zajištění pravidelnosti výroby.

Cizí agens. (2.6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům na inokula.

Neurovirulence (2.6.18). Pracovní inokulum vyhovuje zkoušce neurovirulence živých virových vakcín. Opice Macaca a Cercopithecus citlivé na spalničkový virus jsou vhodné pro tuto zkoušku.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnou bankou a s následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek a v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do živných médií se může přidat povolené sérum zvířecího původu (ale ne lidské), ale konečné médium pro udržení buněčného růstu při pomnožování viru neobsahuje zvířecí sérum. Sérum a trypsin používané při přípravě buněčných suspenzí a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je červeň fenolová, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Při výrobě se doporučuje používat substrát bez antibiotik. Nejméně 500 ml produkčních buněčných kultur se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky). Sklizně virových suspenzí probíhají v době vhodné pro použitý kmen viru.

Pouze sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Sklizeň viru obsahuje virus, který se dokáže jako virus spalniček séroneutralizační zkouškou v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Koncentrace viru ve sklizni se stanoví tak, jak je předepsáno v odstavci Stanovení účinnosti, aby se zajistila stálost výroby a aby se stanovila ředění pro přípravu konečné várky vakcíny.

Cizí agens (2.6.16).

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky kultur produkčních buněk vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Konečná várka vakcíny

Pouze sklizně vyhovující výše uvedeným zkouškám se smíchají a vyčeří, aby se odstranily buňky. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se vhodně zředí.

Pouze konečná várka vakciny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Bakterie a houby. Konečná várka vakciny vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1); na každou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakciny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů a lyofilizuje se na obsah vlhkosti, která je prokazatelně vhodná pro stabilitu vakciny. Potom se obaly uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a vniknutí vlhkosti.

Pouze šarže, která vyhovuje následujícím požadavkům na teplotní stabilitu a všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti se může uvolnit k použití. Pokud byla zkouška na bovinní sérumalbumin provedena s uspokojivým výsledkem na konečné várce vakciny, může se u šarže vypustit.

Teplotní stabilita. Zrychlená zkouška stability se provede inkubací lyofilizovaného přípravku na 37 °C po 7 dní. Koncentrace viru po této době klesne nejvýše o 1 log 10 , než je počáteční hodnota, a v žádném případě není nižší než 1 . 10 3 CCID 50 na dávku.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína, rekonstituovaná podle údajů v označení, smíchá se specifickými spalničkovými protilátkami, není již schopna infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jednotlivé lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virus vakciny se titruje nejméně trojmo na pěti buněčných kulturách pro každé ředění v řadě po 0,5 log 10 nebo metodou o stejné přesnosti.

K validaci každé zkoušky se použije vhodný referenční virový přípravek. Stanovená koncentrace viru není nižší než koncentrace uvedená v označení; minimální koncentrace viru v označení j e nejméně 1 . 10 3 CCID 50 v lidské dávce. Zkouška není platná, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) logaritmu virové koncentrace je větší než ±0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- kmen viru použitý pro přípravu vakcíny,

- typ a původ buněk použitých pro přípravu vakcíny,

- minimální koncentrace viru,

- varování před stykem s dezinfekčními prostředky,

- doba, do které je třeba vakcínu po rekonstituci použít.

Vaccinum panleucopeniae felinae inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti panleukopenii koček

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek z viru panleukopenie koček nebo viru psí parvovirózy inaktivovaného vhodnou metodou.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnožuje ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Virus se může purifikovat a koncentrovat.

Zkouška na rezidua infekčního viru panleukopenie koček se provádí na nerozplněné sklizni každé šarže k potvrzení inaktivace. Množství inaktivovaného viru použitého ve zkoušce odpovídá nejméně 100 dávkám vakcíny. Vakcína se naočkuje na vhodnou, ne zcela narostlou buněčnou kulturu; po inkubaci 8 dní se po trypsinizaci připraví subkultura. Po inkubaci dalších 8 dní se kultury vyšetří na rezidua živých parvovirů imunofluorescenční zkouškou. Imunofluorescenční zkouška se může doplnit hemaglutinační zkouškou nebo jinými vhodnými zkouškami v supernatantu buněčných kultur. Nezjistí se žádný živý virus.

Vakcína může obsahovat jedno nebo více adjuvancií.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska imunogenity u koček. Imunogenita se může prokázat následující zkouškou.

Imunogenita. Použije se deset vnímavých koček 8 až 12 týdnů starých. Každé kočce se odebere vzorek krve a individuálně se vyšetří na nepřítomnost protilátek proti viru panleukopenie koček, aby se zjistila vnímavost. Pět koček se očkuje podle doporučeného plánu. Počty leukocytů se stanoví 8 dní a 4 dny před čelenží, aby se určila výchozí hodnota. 20 až 22 dní od poslední vakcinace se každé kočce intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml suspenze patogenního viru panleukopenie koček. Kočky se pozorují 14 dní. Počty leukoctů se stanoví čtvrtý, šestý, osmý a desátý den po čelenži. U všech pěti kontrolních koček se počet leukocytů sníží nejméně o 75 % oproti výchozí hodnotě; tato zvířata mohou uhynout za příznaků panleukopenie. U vakcinovaných koček nedojde k onemocnění panleukopenii, to znamená, že snížení počtu leukocytů nepřesáhne v žádném ze čtyř odběrů 50 % výchozí hodnoty. Tyto kočky zůstanou zcela zdravé.

Zkouška totožnosti

Po podání kočkám podporuje vakcína tvorbu protilátek proti parvoviru, který je ve vakcíně přítomen.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Způsobem uvedeným v označení se každé ze dvou zdravých vnímavých koček 8 až 12 týdnů starých podá dvojnásobná dávka vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Nezjistí se žádná místní ani systémová reakce.

Sterilita.Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Provede se zkouška A nebo B.

A. Použijí se čtyři vnímavé kočky 8 až 12 týdnů staré. Každé kočce se odebere vzorek krve a vyšetří se individuálně na protilátky proti viru panleukopenie koček, aby se stanovila vnímavost. Každé ze dvou koček se podá způsobem uvedeným v označení jedna dávka vakcíny. Za 21 dní se odebere každé kočce krev a připraví se odděleně vzorek séra. Séra se 30 min inaktivují zahřátím na 56 C. K jednomu objemovému dílu z každého séra se přidá devět objemových dílů suspenze kaolinu lehkého R (200 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným o pH 7,4. Každá směs se míchá 20 min. Po odstředění se odebere supernatantní tekutina a smíchá se s jedním objemem koncentrované suspenze prasečích erytrocytů. Nechá se 60 min inkubovat při 4 C a poté se odstředí. Ředění takto připraveného séra je 1 : 10. Od každého séra se připraví řada dvojnásobných ředění. Ke každému z těchto ředění o objemu 0,025 ml se přidá 0,025 ml suspenze antigenu psí parvovirózy obsahující čtyři hemaglutinační jednotky. Nechá se 30 min inkubovat při 37 C a poté se přidá 0,05 ml suspenze prasečích erytrocytů o koncentraci 30 . 10 6 buněk v mililitru. Inkubuje se 90 min při 4 C a pak se zaznamená poslední ředění séra, kde ještě došlo k úplné inhibici hemaglutinace. Vakcína vyhovuje, jestliže v sérech obou vakcinovaných koček byl zaznamenán titr nejméně 1 : 20. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže obě kontrolní kočky zůstanou séronegativní.

B. Dvě zdravé vnímavé kočky stáří 8 až 12 týdnů, u kterých byl naměřen titr protilátek v 0,1 ml séra při stanovení níže popsanou metodou nižší než 4 ND 50 (padesátiprocentní neutralizační dávka), se vakcinují způsobem uvedeným v označení. Za 14 dní po vakcinaci se vyšetří sérum každého zvířete následujícím postupem. Séra se 30 min zahřívají na 56 C a pak se připraví sériová ředění v médiu vhodném pro kočičí buňky. Ke každému ředění se přidá stejný objem virové suspenze obsahující takové množství viru, které, je-li ve vhodné směsi séra a viru inokulováno na buněčnou kulturu, obsahuje přibližně 10 4 CCID 50 , Směsi se inkubují při 37 C 1 h a každá se inokuluje v odpovídajícím objemu na čtyři buněčné kultury. Buněčné kultury se inkubují při 37 C 7 dní a po následné druhé pasáži dalších 7 dní. Kultury se vyšetřují na přítomnost specifických cytopatických efektů a vypočítá se titr protilátek. Vakcína vyhovuje, jestliže průměrný titr je nejméně 32 ND 5 0 v 0,1 ml séra. Jestliže u jedné kočky nedojde k protilátkové odpovědi, zkouška se opakuje na dalších dvou kočkách a výsledek se vypočítá jako průměrná hodnota všech titrů naměřených u všech tří koček, u kterých došlo k protilátkové odpovědi.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum panleucopeniae felinae infectivae vivum cryodesiccatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti panleukopenii koček lyofilizovaná

Je to přípravek z oslabeného viru panleukopenie koček.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnožuje ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Virová suspenze se sklidí, titruje, ředí vhodným stabilizujícím roztokem a lyofilizuje.

Výběr vakcinačního kmene

Pouze virový kmen prokazatelně uspokojivý z hlediska bezpečnosti a imunogenity se může použít k přípravě vakcíny. K důkazu bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Pěti zdravým vnímavým kočkám dva až čtyři měsíce starým a prostým specifických neutralizujících protilátek se podá subkutánně po 0,5 ml virové suspenze. Toto množství odpovídá třem dávkám vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Odběr krve se provádí 4., 6., 8. a 10. den po podání. Inokulum vyhovuje zkoušce, pokud nejsou zjištěny žádné klinické nebo hematologické změny. U žádného zvířete ani u žádného krevního obrazu neklesne počet leukocytů o více než 50 % počtů zjištěných u dvou odběrů provedených 8. a 4. den před inokulací.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity virového kmene.

Zkoušení šarže

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška vypuštěna z rutinní kontroly jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula, dá-li k tomu souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Vakcína rekonstituovaná podle údajů v označení způsobí ve vnímavé buněčné kultuře cytopatický efekt. Přítomnost viru se může stanovit imunofluorescencí. Neutralizovaná vakcína již nevyvolá cytopatický efekt.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma zdravým vnímavým kočkám ve věku uvedeném v označení se podá doporučeným způsobem dvojitá dávka rekonstituované vakcíny. Zvířata se pozorují 14 dní. Nezjistí se významné místní ani systémové změny.

Cizí viry. Osmi myším hmotnosti 14 g až 16 g se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml rekonstituované vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Nevznikne žádný patogenní efekt. Úhyn zvířete do 24 h po inokulaci se považuje za nespecifický a zvíře se vyřadí. Jestliže jedno zvíře uhyne za 24 h nebo později po inokulaci, zkouška se opakuje. Pokud uhyne jedno zvíře i v druhé zkoušce, vakcína nevyhovuje.

Vakcína se neutralizuje monospecifickým antisérem. Vakcína pak již nevyvolává cytopatický efekt ve vnímavé buněčné kultuře.

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Titr viru. Nejméně 10 3 CCID 50 v dávce. Vakcína se titruje na kultuře kočičích buněk.

Stanovení účinosti

Pěti zdravým vnímavým kočkám ve stáří 2 až 4 měsíce se vstříkne subkutánně po jedné dávce vakcíny. Za 20 až 22 dní se provede čelenž současně s dalšími pěti zdravými a vnímavými kontrolními kočkami stejného stáří. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml suspenze patogenního viru panleukopenie koček. Kočky se pozorují 14 dní. Provede se kontrola počtu leukocytů 4., 6., 8. a 10. den po čelenži. U všech pěti kontrolních koček se projeví snížení počtu leukocytů převyšující 75 % počáteční hodnoty, která byla stanovena 8. a 4. den před inokulací virové suspenze. Tato zvířata mohou uhynout na leukopenii. U pěti vakcinovaných koček se neobjeví příznaky leukopenie a snížení počtu leukocytů nepřevyšuje u žádného ze čtyř počítání 50 % z průměru počáteční hodnoty. Tyto kočky zůstávají zcela zdravé.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení se uvede:

- stáří doporučené pro vakcinaci,

- že se vakcína nepoužívá u březích koček (ledaže by byla prokázána její bezpečnost v takových podmínkách).

Vaccinum parotitidis vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti příušnicím

Je to lyofilizovaný přípravek z vhodného oslabeného kmene viru příušnic (Paramyxovirus parotitidis). Vakcína se rekonstituuje bezprostředně před použitím, jak je uvedeno v označení. Vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace, a je-li virus pomnožován v lidských diploidních buňkách, na systému buněčné banky. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stále stejnou živou vakcínu přiměřené imunogenity a neškodnosti pro člověka. Jestliže není určeno a schváleno jinak, virus v konečné vakcíně neprošel od matečného inokula více pasážemi, než u přípravku, který v klinické studii vyhověl v účinnosti a neškodnosti.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3) nebo v buňkách kuřecího embrya nebo v amniotické dutině kuřecích embryí pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Virové inokulum

Kmen viru příušnic je určen podle průvodních záznamů, které obsahují informaci o jeho původu a následné manipulaci s ním. Aby se předešlo nadměrnému používání opic ve zkoušce na neurovirulenci, připraví se virové inokulum ve velkém množství a uchovává se lyofilizované při teplotách nižších než -20 °C nebo, pokud není lyofilizováno, nižších než - 60 °C.

Pouze virové inokulum vyhovující následujícím předpisům se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. V matečných i pracovních inokulech se prokáže virus příušnic séroneutralizační zkouškou v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Koncentrace viru v matečných i v pracovních inokulech se stanoví pro zajištění pravidelnosti výroby.

Cizí agens (2.6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům pro virové inokulum.

Neurovirulence (2.6.18). Pracovní inokulum vyhovuje zkoušce na neurovirulenci pro živé virové vakcíny. Pro tyto zkoušky jsou vhodné opice Macaca a Cercopithecus.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnou bankou a s následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek a v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do živných médií se může přidat povolené sérum zvířecího původu (ale ne lidské). Sérum a trypsin používané při přípravě buněčných suspenzí a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je červeň fenolová, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Při výrobě se doporučuje používat substrát bez antibiotik. Nejméně 500 ml produkčních buněčných kultur se ponechává neinfikovaných (kontrolní buňky). Pokud je virus pomnožován v kuřecích embryích, ponechávají se 2 % (nejméně dvacet vajec) neinfikovaných. Sklizně virových suspenzí probíhají v době vhodné pro použitý kmen viru.

Pouze sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Sklizeň viru obsahuje virus, který se dokáže jako virus příušnic séroneutralizační zkouškou v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Cizí agens (2.6.16).

Kontrolní buňky nebo vejce. Kontrolní buňky kultur produkčních buněk vyhovují zkoušce totožnosti; kontrolní buňky a kontrolní vejce vyhovují požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Konečná várka vakcíny

Pouze sklizně vyhovující výše uvedeným zkouškám se smíchají a vyčeří, aby se odstranily buňky. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se vhodně zředí.

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Bakterie a houby. Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1); na každou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje následujícím požadavkům na teplotní stabilitu a všem z požadavků uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití. Pokud byla zkouška na bovinní sérumalbumin a případně též ovalbumin provedena s uspokojivým výsledkem na konečné várce vakcíny, mohou být u šarže vypuštěny.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína, rekonstituovaná podle údajů v označení, smíchá se specifickými parotitickými protilátkami, není již schopna infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jednotlivé lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Ovalbumin. Je-li vakcína připravena na kuřecích embryích, obsahuje nejvýše 1 μg ovalbuminu v jednotlivé lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virus vakcíny se titruje nejméně trojmo na pěti buněčných kulturách pro každé ředění v řadě po 0,5 log 10 nebo metodou o stejné přesnosti.

K validaci každé zkoušky se použije vhodný referenční virový přípravek. Stanovená koncentrace viru není nižší než množství uvedené v označení; minimální koncentrace viru v označení je nejméně 5 . 10 3 CCID 50 v lidské dávce. Zkouška není platná, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) logaritmu virové koncentrace je větší než ± 0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení se uvede:

- kmen viru použitý k přípravě vakcíny,

- zda byla vakcína připravena na kuřecích embryích nebo typ a původ buněk použitých k přípravě vakcíny,

- minimální koncentrace viru,

- varování před stykem s dezinfekčními prostředky,

- doba, do které je třeba vakcínu po rekonstituci použít.

Vaccinum parvovirosis caninae inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti parvoviróze psů

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek viru parvovirózy psů inaktivovaného vhodnou metodou.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Virus se může purifikovat a koncentrovat.

Zkouška na rezidua živého viru se provede z nerozplněné sklizně každé šarže, aby se potvrdila inaktivace parvoviru. Množství inaktivovaného viru použitého ke zkoušce odpovídá nejméně 100 dávkám vakcíny. Vakcína se inokuluje na vhodné nesplývající buňky; po osmidenní inkubaci se po trypsinizaci založí subkultura. Po další osmidenní kultivaci se kultura zkouší na přítomnost zbylého živého viru imunofluorescencí. Imunofluorescence se může doplnit hemaglutinací nebo jinou vhodnou zkouškou supematantu z buněčné kultury. Nezjistí se živý virus.

Vakcína může obsahovat jedno nebo více adjuvancií.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska imunogenity pro psy. K průkazu účinnosti (5.2.7) se použijí následující zkoušky.

Imunogenita. Použije se sedm vnímavých psů v minimálním věku doporučeném pro vakcinaci. Od každého psa se odeberou vzorky krve a individuálně se vyšetří na protilátky proti parvoviróze psů k určení vnímavosti. Pět psů se vakcinuje podle doporučeného plánu, dva psi se ponechají jako kontrola. Za 20 až 22 dní po poslední vakcinaci se každému psu oronazálně podá suspenze patogenního psího parvoviru. Psi se pozorují 14 dní a provedou se hemaglutinační zkoušky k průkazu viru ve výkalech. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže dva kontrolní psi mají typické příznaky onemocnění nebo leukopenii a vylučují virus. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže pět vakcinovaných psů zůstává v dobrém zdravotním stavu a nevykazuje známky onemocnění ani leukopenii a jestliže maximální titr viru vylučovaného výkaly je menší než setina geometrického průměru maximálních titrů nalezených u kontrolních zvířat.

Zkouška totožnosti

Po podání psům podporuje vakcína tvorbu protilátek proti parvoviróze psů.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Způsobem uvedeným v označení se každému ze dvou zdravých vnímavých psů v minimálním věku pro vakcinaci podle údajů v označení vstříkne dvojnásobná vakcinační dávka. Zvířata se pozorují 14 dní. Nezjistí se významná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Provede se buď zkouška A, nebo B.

A. Pěti morčatům, která nemají specifické protilátky, se každému subkutánně vstříkne polovina dávky uvedené v označení. Po 14 dnech se opět podání poloviční dávky opakuje. Za dalších 14 dní se odeberou vzorky krve a oddělí sérum. Každé sérum se 30 min inaktivuje zahřátím na 56 °C. K jednomu objemovému dílu každého séra se přidá devět objemových dílů suspenze kaolinu lehkého R (200 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným o pH 7,4. Každá směs se míchá 20 min. Po odstředění se oddělí supematantní tekutina a smíchá se s jedním objemovým dílem koncentrované suspenze prasečích erytrocytů. Ponechá se stát 60 min při 4 °C a odstředí se. Připravená séra jsou tímto postupem naředěna 1 : 10, dále se ředí dvojnásobnou řadou. K 0,025 ml každého posledního ředění se přidá 0,025 ml suspenze psího parvovirového antigenu obsahující 4 hemaglutinační jednotky. Nechá se stát 30 min při 37 °C, potom se přidá 0,05 ml suspenze prasečích erytrocytů obsahující 30.106 buněk/ml. Nechá se stát 90 min při 4 °C a poznamená se poslední ředění séra, které ještě úplně inhibuje hemaglutinaci. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže střední titr protilátek v sérech odebraných po druhé vakcinaci je nejméně 1 : 80.

B. Vakcinace se provede podle plánu v označení dvěma zdravým vnímavým psům starým 8 až 12 týdnů, kteří mají titr protilátek nižší než 4 ND 50 (50% neutralizační dávky) v 0,1 ml séra stanovený dále popsanou metodou. Za 14 dní po vakcinaci se sérum každého zvířete zkouší následovně. Sérum se 30 min zahřívá na 56 °C a připraví se sériové ředění v médiu vhodném pro psí buňky. Ke každému ředění se přidá stejný objem virové suspenze obsahující takové množství viru, že když se objem směsi séra a viru vhodný pro zkušební systém inokuluje do buněčných kultur, je v každé kultuře asi 10 4 CCID 50 Směsi se 1 h inkubují při 37 °C a poté se inokuluje na čtyři kultury psích buněk vhodným objemem každé směsi. Buněčné kultury se 7 dní inkubují při 37 °C. Potom se provede pasáž a subkultury se inkubují dalších 7 dní. Kultury se vyšetřují na přítomnost specifického cytopatického efektu a stanoví se titr protilátek. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže průměrný titr je nejméně 32 ND 50 v 0,1 ml séra. Jestliže jeden pes nevykazuje vzestup protilátek, opakuje se zkouška na dalších dvou psech a výsledek se stanoví z průměrného titru protilátek naměřeného u tří psů, kteří vykázali protilátkovou odpověď.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum parvovirosis caninae vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti parvoviróze psů

Je to přípravek z kmene psího parvoviru, který je oslaben pro psy.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Oslabený virus se pomnoží ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4).

Virová suspenze se sklidí, titruje a smíchá s vhodným stabilizujícím roztokem. Vakcína se může lyofilizovat.

Pouze virový kmen, který je prokazatelně postačující s ohledem na bezpečnost, nevratnost oslabení a imunogenitu, se může použít pro výrobu vakcíny. Bezpečnost (5.2.6) a účinnost (5.2.7) se prokážou následujícími zkouškami.

Bezpečnost. Pro každý doporučený způsob podání se provede zkouška.

Pro zkoušku se použije pět vnímavých štěňat bez hemaglutinačně inhibičních protilátek proti psímu parvoviru v minimálním věku pro vakcinaci doporučeném v označení. Počet bílých krvinek v obíhající krvi se stanoví 4 a 2 dny před podáním a v den podání vakcinačního kmene. Každému štěněti se podá jedním ze způsobů doporučených v označení množství viru odpovídající nejméně desetinásobku maximálního titru viru, který se může očekávat u šarže vakcíny při nejnižším stupni pasáže viru. Štěnata se pozomjí 21 dní. Stanovení počtu bílých krvinek v obíhající krvi se provádí 3., 5., 7. a 10. den po injekci. Štěňata zůstanou zdravá a neobjeví se abnormální lokální ani systémová reakce. Pokles obíhajících bílých krvinek nepřesahuje 50 % původního počtu, který je průměrem tří hodnot zjištěných před vstříknutím vakcinačního kmene.

Množství viru odpovídající nejméně desetinásobku nejvyššího titru, který lze očekávat u šarže vakcíny a při nejnižším stupni pasáže viru, se podá jedním z dopomčených způsobů každému z pěti vnímavých štěňat. Pět štěňat se drží jako kontrola. Dvě štěňata z každé skupiny se usmrtí za 14 dní a zbývající tři z každé skupiny za 21 dní. Provede se histologické vyšetření thymu všech zvířat. Mírná hypoplazie thymu může být zřejmá po 14 dnech. Kmen není přijatelný, je-li poškození zřejmé po 21 dnech.

Nevratnost oslabení. Množství viru odpovídající desetinásobku maximálního titru, který se může očekávat u šarže vakcíny, se podá jedním ze způsobů dopomčených v označení každému ze dvou vnímavých štěňat, která nemají hemaglutinačně inhibiční protilátky proti psímu parvoviru a jsou v nejnižším dopomčeném věku pro vakcinaci. Od druhého do desátého dne po podání viru se odebírají výkaly od každého štěněte a prověří na přítomnost viru. Výkaly obsahující virus se smíchají. 1 ml suspenze smíchaných výkalů se podá oronazální cestou každému ze dvou dalších štěňat stejného věku a vnímavosti. Tento postup se provede čtyřikrát. Přítomnost viru se ověří v každé pasáži. Jestliže se virus nezjistí, provede se druhá řada pasáží. Jestliže se virus nezjistí v jedné pasáži z druhé řady, vakcinační kmen vyhovuje zkoušce. Žádné štěně neuhyne nebo nemá příznaky, které by se daly přičíst vakcíně. Nezjistí se známky vzestupu virulence ve srovnání s původním vakcinačním virem. V úvahu se bere zejména počet bílých krvinek, výsledky histologických vyšetření thymu a titr vylučovaného viru.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k prokázání imunogenity kmene.

Zkoušení šarže

Pokud se provede stanovení účinnosti s vyhovujícím výsledkem na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní zkoušce jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěna, dá-li k tomu souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Vakcína se pomnoží ve vnímavých buněčných liniích v prostředí vhodném pro průkaz pomocí fluorescenčních protilátek nebo pro imunoperoxidasové zkoušky včetně vhodných kontrol. Část buněk se zkouší monoklonálními protilátkami specifickými pro psí parvovirus a část buněk se zkouší monoklonálními protilátkami specifickými pro kočičí parvovirus. V buňkách naočkovaných vakcínou je detekován antigen psího parvoviru, ale není zjištěn kočičí parvovirus.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě štěňata v nejnižším věku pro vakcinaci uvedeném v označení, přednostně taková, která nemají hemaglutinačně-inhibiční protilátky proti psímu parvoviru. Každému se podá deset dávek vakcíny jedním ze způsobů podle označení a pozorují se 14 dní. Psi zůstávají v dobrém zdravotním stavu bez abnormálních lokálních nebo systémových reakcí.

Cizí viry. Vakcína se smíchá s vhodným antisérem proti psímu parvoviru a inokuluje se do buněčných kultur, o nichž je známo, že jsou vnímavé na psí patogenní viry. Nerozvine se žádný cytopatický efekt. Nejsou žádné známky hemaglutinačních a hemadsorpčních agens ani jiné znaky přítomnosti cizích virů.

Bakterie a houby. Vakcína, je-li třeba rekonstituovaná, vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata. Vakcína, je-li třeba rekonstituovaná, vyhovuje zkoušce na mykoplazmata (neaviární mykoplazmata a ureoplazmata).

Titr viru. Je-li třeba, vakcína se rekonstituuje podle označení a titruje se ve vhodných buněčných kulturách. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použije se sedm vnímavých štěňat, která nemají hemaglutinačně-inhibiční protilátky proti psímu parvoviru a jsou v nejnižším věku pro vakcinaci uvedeném v označení. Dvě štěňata se nechají jako kontrola a ostatním se podá jedním ze způsobů uvedených v označení takové množství viru, které odpovídá nejnižšímu titru uvedenému v označení. Všechna štěňata se pozorují 20 až 22 dní a potom se každému podá oronazální cestou suspenze virulentního psího parvoviru. Všechna zvířata se pozorují 14 dní a provede se hemaglutinační zkouška na virus ve výkalech. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže dvě kontrolní štěňata mají typické příznaky nemoci a případně také leukopenii a vylučují virus. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže pět vakcinovaných štěňat zůstává v dobrém zdravotním stavu a nemá příznaky nemoci ani leukopenii a jestliže maximální titr viru vylučovaného výkaly je menší než setina geometrického průměru nejvyšších titrů nalezených u kontrolních zvířat.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum parvovirosis inactivatum ad suem ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti parvoviróze prasat

Je to suspenze inaktivovaného parvoviru prasat nebo neinfekčních částic tohoto viru.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnožuje ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Suspenze viru se sklidí, virus se inaktivuje metodou, která zabrání ztrátě jeho imunogenity, může se rozbít (může se inaktivovat dezintegrací). Virus nebo virové částice se mohou purifikovat a koncentrovat ve vhodném stupni výrobního postupu.

U každé šarže antigenu se provede zkouška na rezidua infekčního parvoviru prasat ihned po inaktivaci z celkového konečného množství nebo, jestliže vakcína obsahuje adjuvans, provede se kontrola z celkového množství antigenu nebo ze směsi bezprostředně před přidáním adjuvans. Ke zkoušce se použije množství odpovídající nejméně 100 dávkám vakcíny. Nerozplněná sklizeň se inokuluje na vhodné nesplývající buňky, po sedmidenní inkubaci se připraví subkultura po trypsinizaci buněk, po inkubaci dalších 7 dnů se kultury vyšetří imunofluorescenční zkouškou na rezidua živého parvoviru. Nezjistí se živý virus.

Vakcína může obsahovat jedno nebo více vhodných adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti (včetně toho, že nemá nežádoucí účinky na plodnost, březost, porodnost, potomstvo) a je imunogenní pro prasata. Bezpečnost (5.2.6) a účinnost (5.2.7) se mohou prokázat následujícími zkouškami.

Bezpečnost.

A. Zkouška se provádí s každou kategorií zvířat, pro které je vakcína určena, a všemi doporučenými způsoby. Použitá zvířata nemají protilátky proti prasečímu parvoviru nebo frakcím viru. Dvě dávky vakcíny se podají zamýšleným způsobem každému z nejméně deseti zvířat. Po 14 dnech se každému zvířeti podá ještě jedna dávka vakcíny. Zvířata se pozorují dalších 14 dnů. Během 28 dnů trvání této zkoušky se nezjistí žádné abnormální místní nebo systémové reakce. Jestliže je vakcína určena pro březí prasnice, prodlouží se zkouška v této kategorii zvířat do doby porodu a nezjistí se žádný vliv na březost či potomstvo.

B. Zvířata používaná ke zkoušce imunogenity jsou také používána k hodnocení bezpečnosti. Každému vakcinovanému zvířeti se měří rektální teplota při vakcinaci a za 24 h a 48 h po vakcinaci. Nedojde k abnormálnímu účinku na teplotu těla nebo jiným celkovým reakcím (např. anorexie). Místo vpichu se vyšetří na lokální reakce po vakcinaci a na jatkách. Nezjistí se nadměrné lokální reakce.

C. Rovněž zvířata používaná k terénním pokusům jsou využita k hodnocení bezpečnosti. Zkouška se provádí na každé kategorii zvířat, pro kterou je vakcína určena (prasnice, prasničky). Použijí se nejméně tři skupiny zvířat, v každé skupině nejméně dvacet kusů, v kontrolní skupině nejméně deset kusů. Rektální teplota se měří při vakcinaci a za 24 h a 48 h po vakcinaci. Nedojde k abnormálnímu účinku na teplotu těla. Místo vpichu se vyšetří na lokální reakce po vakcinaci a na jatkách. Nezjistí se nadměrné lokální reakce.

Imunogenita. Zkouška popsaná jako Stanovení účinnosti se může použít k důkazu imunogenity vakcíny.

kouka innosti arže

Dále popsaná zkouška se neprovádí při rutinním zkoušení šarží vakcíny. Provede se s danou vakcínou při jedné nebo více příležitostech podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority; kde se tato zkouška neprovede, nahradí se vhodnou validovanou zkouškou. Kritéria pro přijetí se stanoví ze vztahu k šarži vakcíny, která dávala vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Následující zkouška se může použít po uspokojivé korelaci se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti, které bylo dosaženo statistickým vyhodnocením.

Subkutánně se vakcinuje nejméně pět morčat ve stáří 5 až 7 týdnů podle vakcinačního schématu uvedeného v označení; použije se jedna čtvrtina objemu předepsané dávky. Odeberou se vzorky krve v době po maximální tvorbě protilátek a provedou se zkoušky se sérem na specifické protilátky hemaglutinačně-inhibičním testem nebo jinou vhodnou zkouškou. Titry protilátek nejsou nižší než titry získané s šarží vakcíny, která vyhověla ve zkoušce na prasatech (viz Stanovení účinnosti).

Zkouška totožnosti

Vakcína podaná jednou nebo, je-li třeba, vícekrát vnímavým zvířatům povzbuzuje tvorbu specifických protilátek proti parvoviru prasat nebo frakcím tohoto viru používaným k přípravě vakcíny.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě prasata ve stáří 6 týdnů až 6 měsíců, která nemají protilátky proti parvoviru prasat nebo frakcím tohoto viru. Každé zvíře se očkuje dvojnásobnou dávkou vakcíny způsobem uvedeným v označení. Zvířata se pozorují 14 dnů a každému praseti se vstříkne ještě jednoduchá dávka. Zvířata se pozorují dalších 14 dnů. Nezjistí se žádné nadměrné místní ani systémové reakce během 28 dnů zkoušky.

Inaktivace. Zkoušku může výrobce vypustit, jestliže byla provedena s nerozplněnou vakcínou, bezprostředně před přidáním adjuvancia, je-li to vhodné.

Použije se množství vakcíny odpovídající deseti dávkám. Jestliže vakcína obsahuje olejové adjuvans, rozloží se emulze a oddělí se fáze. Jestliže vakcína obsahuje minerální adjuvans, provede se eluce k uvolnění viru. Virová suspenze se stokrát koncentruje ultrafiltrací nebo ultracentrifugací. Žádný z výše uvedených postupů nesmí inaktivovat nebo jinak vadit detekci živého viru. Provede se zkouška na rezidua živého viru na vhodných nesplývajících buňkách, po sedmidenní inkubaci se po trypsinizaci připraví subkultura a po další sedmidenní inkubaci se kultury vyšetří na rezidua živého parvoviru imunofluorescencí. Nezjistí se živý virus.

Cizí viry. U prasat použitých na zkoušku bezpečnosti se vyšetří protilátky. Vakcína vytváří protilátky pouze proti parvoviru prasat, nepodporuje tvorbu protilátek proti jiným patogenním virům pro prasata nebo proti virům, jež mohou bránit diagnostice jiných infekcí prasat (včetně viru moru prasat).

Sterilita.Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Nejméně sedm prasniček ve stáří 5 až 6 měsíců, které nemají protilátky proti parvoviru prasat nebo proti frakcím tohoto viru, se vakcinuje podle doporučeného plánu. Interval mezi vakcinací a připouštěním je uveden v návodu. Připouštějí se prasniěky dva po sobě následující dny s příznaky říje. Nejméně pět nevakcinovaných připuštěných prasniček stejného věku se použije jako kontroly. Kolem 40. dne březosti se všechny prasniěky čelenžují vhodným kmenem parvoviru prasat. Prasniěky se v 90 dnech březosti porazí a jejich plody se vyšetří na infekci parvovirem prasat. Prokazuje se buď nepřítomnost viru, nebo protilátek. Vakcína vyhovuje, jestliže nejméně 80 % z celkového počtu selat od vakcinovaných prasniček je chráněno proti infekci. Zkoušku lze hodnotit jen v případě, že nejméně sedm vakcinovaných a pět kontrolních prasniček bylo čelenžováno; nejméně 90 % selat kontrolní skupiny je infikováno, průměrný počet selat na jeden vrh od vakcinovaných prasniček je nejméně šest.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum pertussis ⟪MEDIA:img_001⟫

Vakcína proti dávivému kašli

Synonymum. Očkovací látka proti dávivému kašli

Je to sterilní suspenze inaktivovaných celých buněk jednoho nebo více kmenů mikroba Bordetella pertussis ve fyziologickém roztoku.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Použije se jeden nebo více kmenů mikroba B. pertussis známého původu a udržování. Kmeny, živná půda a kultivační metoda se volí tak, aby v hotovém přípravku byly zastoupeny aglutinogeny 1, 2 a 3. Každý kmen se pěstuje 24 h až 72 h v tekuté půdě nebo na pevné půdě; půda použitá při posledním kultivačním stupni neobsahuje krev nebo krevní deriváty. Lidská krev ani krevní deriváty z ní připravené se v živných půdách nepoužijí. Bakterie se sklidí z půdy, promytím se odstraní příměsi pocházející z živné půdy a bakterie se suspendují v roztoku chloridu sodného (9 g/l) nebo v jiném vhodném izotonickém roztoku. Denzita suspenze se stanoví nejpozději dva týdny po stažení z půdy porovnáním s mezinárodním referenčním přípravkem denzity a takto získaná hodnota se použije jako základ pro výpočet v následujících krocích při přípravě vakcíny. Hodnotu mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Konečná várka vakcíny

Vhodná množství již inaktivovaných jednotlivých sklizní se smíchají a připraví se konečná várka vakcíny. Je možno přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Koncentrace bakterií v konečné várce by neměla odpovídat denzitě větší než 20 m.j. na jednu lidskou dávku. Pokud se použijí dva nebo více kmenů B. pertussis, je složení po sobě jdoucích šarží vycházejících z konečné várky vakcíny stejné, pokud jde o zastoupení každého kmene vyjádřené v jednotkách denzity.

K přípravě šarže přípravku se použije pouze ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu za použití 10 ml zkoušené látky pro každou živnou půdu.

Účinnost. Provede se zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Zkouška totožnosti

Totožnost zkoušeného přípravku se prokazuje aglutinací obsažených bakterií specifickými antiséry proti B. pertussis.

Zkoušky na čistotu

Specifická neškodnost. Nejméně deset zdravých myší o hmotnosti 14 g až 16 g se použije pro skupinu zkoušenou i kontrolní. Myši jsou stejného pohlaví nebo obě pohlaví jsou ve skupinách rovnoměrně zastoupena. Zvířata mají mít přístup k potravě a vodě po celou zkoušku a nejméně 2 h před jejím začátkem. Každé myši ze zkoušené skupiny se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml tak, aby dávka obsahovala množství vakcíny odpovídající nejméně polovině jedné lidské dávky. Každé myši z kontrolní skupiny se vstříkne 0,5 ml sterilního roztoku chloridu sodného R (9 g/l) obsahujícího pokud možno stejné množství protimikrobní konzervační látky, které bylo podáváno ve vakcíně. Obě skupiny se zváží těsně před začátkem zkoušky a pak 72 h a 7 dní po podání. Vakcína vyhovuje požadavkům zkoušky jestliže: a) po 72 h není celková hmotnost skupiny očkovaných myší menší než před zkouškou, b) po sedmi dnech není průměrný přírůstek hmotnosti očkovaných myší menší než 60 % průměrného přírůstku hmotnosti myší kontrolních a c) během zkoušky neuhyne více než 5 % očkovaných myší.

Volný formaldehyd. Po inaktivaci formaldehydem vakcína vyhovuje požadavkům uvedeným v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Nejméně nejnižší prokazatelně účinné množství, nejvýše 115% deklarovaného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Provede se stanovení účinnosti vakcíny proti dávivému kašli (2.7.7).

Stanovená účinnost je nejméně 4 m.j. v jedné lidské dávce a dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 2 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce,

- že přípravek se před použitím roztřepe,

- že přípravek nesmí zmrznout.

Vaccinum pertussis adsorbatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Adsorbovaná vakcína proti dávivému kašli

Je to sterilní suspenze inaktivovaných celých buněk jednoho nebo více kmenů Bordetella pertussis ve fyziologickém roztoku, ke které byl přidán hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Použije se jeden nebo více kmenů mikroba B. pertussis známého původu a udržování. Kmeny, živná půda a kultivační metoda se volí tak, aby v hotovém přípravku byly zastoupeny aglutinogeny 1, 2 a 3. Každý kmen se pěstuje 24 h až 72 h v tekuté půdě nebo na pevné půdě; půda použitá při posledním kultivačním stupni neobsahuje krev nebo krevní deriváty. Lidská krev ani krevní deriváty z ní připravené se v živných půdách nepoužijí. Bakterie se sklidí, promytím se odstraní příměsi pocházející z živné půdy a bakterie se suspendují v roztoku chloridu sodného (9 g/l) nebo v jiném vhodném izotonickém roztoku. Denzita suspenze se stanoví nejpozději dva týdny po sklizni porovnáním s mezinárodním referenčním preparátem denzity a takto získaná hodnota se použije jako základ pro výpočet v následujících krocích při přípravě vakcíny. Hodnotu mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Konečná várka vakcíny

Vhodná množství již inaktivovaných jednotlivých sklizní se smíchají a připraví se konečná várka vakcíny. K suspenzi buněk se přidá hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý. Je možno přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Koncentrace bakterií v konečné várce by neměla přesahovat koncentraci odpovídající denzitě 20 m.j. na jednu lidskou dávku. Pokud se použijí dva nebo více kmenů B. pertussis, je složení šarží vycházejících z konečné várky vakcíny stejné, pokud jde o zastoupení každého kmene vyjádřené v jednotkách denzity.

K přípravě šarže se použije konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látka. 85 % až 115 % zamýšleného množství; pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provede se zkouška popsaná ve stati Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

K použití může být uvolněna pouze šarže, která odpovídá všem požadavkům dále uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Pokud byly zkoušky specifické neškodnosti, stanovení obsahu volného formaldehydu a protimikrobní konzervační látky a stanovení účinnosti provedeny s vyhovujícími výsledky u konečné várky vakcíny, mohou se u šarže vypustit.

Zkouška totožnosti

Ve zkoušeném přípravku se rozpustí takové množství citronanu sodného R, aby výsledná koncentrace byla 100 g/l. Inkubuje se 16 h při 37 °C a odstředěním se získá sediment obsahující bakterie. Je možno použít i jiné vhodné metody oddělení bakterií od nosiče. Totožnost přípravku se prokáže aglutinací bakterií v resuspendovaném sedimentu specifickými antiséry proti B. pertussis nebo zkouškou popsanou ve stati Stanovení účinnosti.

Zkoušky na čistotu

Specifická neškodnost. Nejméně deset zdravých myší hmotnosti 14 g až 16 g se použije pro skupinu zkoušenou i kontrolní. Myši mají být stejného pohlaví nebo mají být obě pohlaví ve skupinách rovnoměrně zastoupena. Zvířata mají mít přístup k potravě a vodě po celou zkoušku a nejméně 2 h před jejím začátkem. Každé myši ze zkoušené skupiny se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml tak, aby dávka obsahovala množství vakcíny odpovídající nejméně polovině jedné lidské dávky. Každé myši z kontrolní skupiny se vstříkne 0,5 ml sterilního roztoku chloridu sodného R (9 g/l) obsahujícího pokud možno stejné množství protimikrobní konzervační látky, které bylo podáváno ve vakcíně. Obě skupiny se zváží těsně před začátkem zkoušky a pak za 72 h a za 7 dní po podání. Vakcína vyhovuje požadavkům zkoušky jestliže: a) po 72 h není celková hmotnost skupiny očkovaných myší menší než před zkouškou, b) po sedmi dnech není průměrný přírůstek hmotnosti očkovaných myší menší než 60 % průměrného přírůstku hmotnosti myší kontrolních a c) během zkoušky uhyne nejvýše 5 % očkovaných myší.

Hliník. Pokud se jako nosič použije hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Vápník. Pokud se jako nosič použije fosforečnan vápenatý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Po inaktivaci formaldehydem přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Nejméně nejnižší prokazatelně účinné množství, nejvýše 115% deklarovaného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Provede se stanovení účinnosti vakcíny proti dávivému kašli (2.7.7).

Stanovená účinnost je nejméně 4 m.j. v jedné lidské dávce a dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 2 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se dále uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce,

- název a množství nosiče,

- že přípravek se před použitím roztřepe,

- že přípravek nesmí zmrznout.

Vaccinum pestis classicae suillae vivum cryodesiccatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti klasickému moru prasat lyofilizovaná

Je to přípravek z kmene viru klasického moru prasat, který ztratil svoji patogenitu pro prasata pasážováním v buněčných kulturách nebo na králících.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Pro vakcíny připravené na králících se inokulum (nebo vakcína) získává z homogenizo vaných orgánů nebo z krve králíků pocházejících ze zdravých chovů, kteří se usmrtí při nejvyšším vzestupu teploty po intravenózním podání viru. Vakcína se lyofilizuje.

Výběr vakcinačního kmene

Pouze virový kmen, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska následujících charakteristik, se může použít k přípravě vakcíny: bezpečnost, nepřenosnost, nevratnost oslabení a imunogenní vlastnosti. K průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Vakcinační dávky použité ve všech následujících zkouškách jsou stanoveny výrobcem na základě předpokusů.

Zkoušky na prasatech

Výběr zvířat. Selata jsou ve stáří 6 až 7 týdnů; prasnice jsou prvničky. Všechna zvířata jsou zdravá a neměla kontakt s virem moru prasat. Sérologicky jsou prosta protilátek proti moru prasat a proti virové diarei skotu (BVD). Návykový čas na ustájovací prostor, ve kterém mají být zkoušky prováděny, je 1 týden.

Bezpečnost.

a) Každému z pěti selat se intramuskulárně vstříkne v jedné injekci desetinásobná vakcinační dávka (skupina a).

b) Pět selat je 5 po sobě jdoucích dní imunosuprimováno denně dávkou 2 mg prednisolonu na kg živé hmotnosti; třetí den se selatům podá jedna dávka vakcíny (skupina b).

Zvířata skupin (a) a (b) se pozorují po dobu 21 dnů. Zůstanou v dobrém zdravotním stavu; jejich teplotní a váhová křivka se signifikantně neliší od kontrolní skupiny.

c) Deset neimunních březích prasnic se intramuskulárně navakcinuje mezi 24. a 35. dnem březosti, každá dvěma vakcinačními dávkami jednorázově. Dalším deseti neimunním březím prasnicím stejného stáří a ze stejného chovu se podá místo dvou vakcinačních dávek vakcíny stejný objem roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Vakcinační virus nevyvolá abnormality během březosti nebo u selat.

Nepřenosnost. Dvanáct selat stejného původu je ustájeno společně. Šest z nich se obvyklým způsobem vakcinuje, ostatních šest se chová jako kontaktní kontroly. Za 40 dní se všechna zvířata čelenžují intramuskulárně dostatečným množstvím čelenžního viru (viz Stanovení účinnosti), které usmrtí neočkované sele během 7 dnů. Vakcinovaná selata infekci odolají, zatím co kontaktní kontroly jeví typické příznaky moru prasat.

Nevratnost oslabení. Každému ze dvou selat se intramuskulárně vstříkne jedna vakcinační dávka. Za 7 dnů po podání se každému odebere 5 ml krve a vzorky krve se smíchají. Vždy 5 ml této krve se intramuskulárně vstříkne dalším dvěma selatům. Tento postup se opakuje šestkrát. Zvířata nemají příznaky moru prasat a vykazují normální vzrůst.

Imunogenní vlastnosti. Imunogenní vlastnosti se mohou prokázat metodou popsanou pro stanovení účinnosti. Množství viru odpovídající jedné vakcinační dávce obsahuje nejméně 100 PD 50 .

Zkoušky totožnosti

A. U vakcín připravených z králíků a takových, které pocházejí z králičích buněčných kultur, se intravenózně vstříkne 0,5 ml vakcíny rekonstituované podle údajů v označení jednomu nebo více neimunizovaným králíkům. Právě tak se imunizuje jeden nebo více králíků, kteří buď nejméně 10 dnů, nejvýše však 2 měsíce před tím byli imunizováni stejným způsobem a stejnou dávkou vakcíny téhož typu, nebo byli imunizováni několik hodin před aplikací vakcíny podáním dostatečné dávky imunního séra. Ráno a večer se králíkům měří tělesná teplota, počínaje 24 hod po aplikaci, denně až do pátého dne po aplikaci. Vakcína je identifikována svými specifickými, teplotu způsobujícími vlastnostmi, které jen u neimunních králíků způsobí vzestup teploty nejméně o 1,5 °C.

B. U vakcín z buněčných kultur, které nejsou připravovány z králíků, sérum z prasat imunizovaných vakcínou neutralizuje virus používaný k výrobě vakcíny.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se tři selata vyhovující požadavkům předepsaným pro volbu zvířat v odstavci Výběr vakcinačního kmene. Každému seleti se intramuskulárně vstříkne v jedné injekci deset dávek rekonstituované vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dnů. Teplotní křivka zůstává normální a zvířata zůstávají zjevně zdravá a vykazují normální růst.

Cizí viry. Vakcína se smíchá s monospecifickým antisérem a inokuluje se do vhodných buněčných kultur. Nevytvoří se cytopatický efekt. Provede se hemaglutinační zkouška ze supernatantu tkáňových kultur při použití kuřecích červených krvinek. Výsledek je negativní. Rovněž provedená hemadsorpční zkouška na buněčných kulturách je negativní.

Vakcína se naředí tak, že 1 dávka je obsažena v 1 ml. Deseti myším hmotnosti 11 g až 15 g se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml rekonstituované vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dnů. Pokud během prvních 48 h po podání uhyne více než dvě myši, zkouška se opakuje. Myši nevykazují v době 3 až 21 dnů po podání žádné abnormality, jež by bylo možno přisoudit vakcíně.

Bakterie a houby. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Stanovení účinnosti

Účinnost se vyjadřuje jako počet dávek, které prasatům poskytují 50% ochranu (PD 50 ) ajsou obsaženy ve vakcinační dávce uvedené v označení. Vakcína obsahuje nejméně 100 PD 50 ve vakcinační dávce.

Ke zkoušce se použijí selata, která vyhovují požadavkům na volbu zvířat popsaným v odstavci Výběr vakcinačního kmen. Dvěma skupinám po pěti selatech se intramuskulárně vstříkne:

- 1/40 dávky vakcíny každému seleti prvé skupiny,

- 1/160 dávky vakcíny každému seleti druhé skupiny.

Dvě selata slouží jako kontroly. Ředění se připraví pomocí tlumivého roztoku fyziologického o pH 7,2. Za 14 dní se každému imunizovanému i kontrolnímu zvířeti intramuskulárně vstříkne dávka čelenžního viru dostačující k tomu, aby nevakcinované sele uhynulo v průběhu 7 dnů po čelenži. Čelenžní virový materiál pozůstává z krve prasat, která byla infikována experimentálně virem, jenž nebyl pasážován na buněčných kulturách. Kontrolní zvířata uhynou v průběhu 7 dnů po čelenži. Imunizovaná zvířata se pozorují 14 dnů. Z počtu zvířat, která přežijí bez příznaků moru prasat, se vhodnou statistickou metodou vypočítá počet PD 50 obsažených ve vakcíně.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede, zda byla vakcína připravena v buněčných kulturách nebo na králících.

Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum ⟪MEDIA:img_001⟫

Polysacharidová vakcína proti pneumokokům

Je to směs stejných podílů purifikovaných antigenů pouzderného polysacharidu připravených z vhodných patogenních kmenů bakterie Streptococcus pneumoniae, jejichž pouzdra prokazatelně obsahují polysacharidy, které jsou schopné u člověka vyvolat tvorbu dostatečných hladin specifických protilátek. Vakcína obsahuje dvacet tři imunochemicky odlišných pouzderných polysacharidů, které jsou uvedeny v tabulce 1.

Vakcína je čirá, bezbarvá tekutina.

Výroba

Výroba je založena na systému jednotné inokulace, odděleně pro každý typ polysacharidu. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stále stejnou vakcínu přiměřené bezpečnosti a imunogenity pro člověka.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a humánních vakcín (2.6.9) takto přizpůsobené pro morčata: každému z deseti morčat se vstříkne po deseti lidských dávkách a pozorují se 12 dní.

Monovalentní nerozplněné množství polysacharidu

Bakterie se pěstují ve vhodné tekuté živné půdě, která neobsahuje antigenní substance krevních skupin nebo vysokomolekulární polysacharidy. Ověří se bakteriální čistota kultury a kultura se inaktivuje fenolem. Nečistoty se odstraní takovými technikami, jako frakční precipitací, enzymatickým štěpením nebo ultrafiltrací. Polysacharid se získá frakční precipitací, promyje se a vysuší ve vakuu na takový obsah zbytkové vlhkosti, který je prokazatelně vhodný pro stabilitu polysacharidu. Obsah zbytkové vlhkosti se stanoví sušením za sníženého tlaku nad oxidem fosforečným nebo termogravimetrickou analýzou a získaná hodnota se použije pro výpočet výsledků dále uvedených zkoušek, které odkazují na vysušenou látku. Nerozplněné monovalentní polysacharidy se uchovávají při vhodné teplotě a za podmínek, které brání zvlhnutí.

Pouze monovalentní nerozplněné polysacharidy, které vyhovují následujícím požadavkům, se mohou použít k přípravě konečné várky vakcíny. Obsahy jednotlivých složek v procentech, stanovené níže popsanými metodami, jsou uvedeny v tabulce 1.

Bílkovina (2.5.16).

Nukleové kyseliny (2.5.17).

Celkový dusík (2.5.9).

Fosfor (2.5.18).

Velikost molekul. Stanoví se chromatografií na molekulárním sítu (2.2.30) za použití agarosy síťované pro chromatografii R nebo agarosy síťované pro chromatografii R1.

Uronové kyseliny (2.5.22).

Hexosaminy (2.5.20).

Methylpentosy (2.5.21).

O-Acetyl skupiny (2.5.19).

Zkouška totožnosti (2.7.1). Totožnost monovalentního nerozplněného polysacharidu se potvrdí dvojitou imunodifuzí nebo elektroimunodifuzí (kromě polysacharidů 7F, 14 a 33F) za použití specifických antisér.

Tab. 1. Obsah složek monovalentních nerozplněných polysacharidů v procentech

⟪TABLE:tbl_001⟫

* Jednotlivé typy polysacharidů jsou označeny podle dánské nomenklatury.

** agarosa síťovaná pro chromatografii R

*** agarosa síťovaná pro chromatografii R1

Specifita. Antigeny při zkoušení nereagují s žádným antisérem specifickým pro ostatní polysacharidy vakcíny, včetně faktorových sér pro rozlišení jednotlivých typů v rámci skupin. Polysacharidy se zkoušejí v koncentraci 50 μg/ml metodou schopnou rozlišit koncentraci 0,5 μg/ml.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny vznikne smícháním vysušených různých polysacharidů za aseptických podmínek. Homogenní směs se asepticky rozpustí ve vhodném izotonickém roztoku tak, aby jedna lidská dávka 0,5 ml obsahovala 25 μg každého polysacharidu. Může se přidat protimikrobní konzervační látka. Roztok se sterilizuje filtrací přes filtr zachycující bakterie.

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům se může použít k přípravě šarže.

Protimikrobní konzervační látka. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů.

Pouze šarže, která vyhovuje všem dále uvedeným požadavkům v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu, Stanovení obsahu se může uvolnit k použití. Pokud byla stanovení obsahu fenolu a protimikrobní konzervační látky provedena s vyhovujícím výsledkem u konečné várky vakcíny, mohou se u šarže vypustit. Jestliže byla na vhodném počtu po sobě následujících šarží prokázána konzistentnost výroby, může se stanovení obsahu nahradit kvalitativní zkouškou, která prokáže totožnost každého polysacharidů, a to pokud bylo stanovení obsahu provedeno u každého monovalentního nerozplněného polysacharidů použitého k přípravě šarže vakcíny.

Zkouška totožnosti

Stanovení obsahu slouží rovněž jako průkaz totožnosti vakcíny.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 7,4.

Protimikrobní konzervační látka. Pokud je třeba, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah není nižší než nejnižší prokazatelně účinné množství a vyšší než 115 % hodnoty uvedené v označení.

Fenol (2.5.15). Nejvýše 2,5 g/l.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje ve zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne 1 ml zředěné vakcíny obsahující od každého polysacharidu 2,5 μg/ml.

Stanovení obsahu

Obsah jednotlivých polysacharidů se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), při níž se použijí specifická antiséra proti všem polysacharidům obsaženým ve vakcíně, včetně faktorových sér pro typizaci uvnitř jednotlivých skupin, a jednotlivé purifikované polysachridy jako standardy.

Vakcína obsahuje 70 % až 130 % množství uvedeného pro každý polysacharid v označení. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení je v rozmezí 80 % až 120 %.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení se uvede:

- množství každého jednotlivého polysacharidu v jedné lidské dávce udané v mikrogramech,

- celkové množství polysacharidů v obale.

Vaccinum poliomyelitidis inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti poliomyelitidě

Je to vodná suspenze vhodných kmenů poliomyelitického viru typu 1, typu 2 a typu 3 pomnožených ve vhodných buněčných kulturách a inaktivovaných vhodnou metodou. Je to čirá tekutina.

Výroba

Výroba je založena na systému jednotné inokulace a virus v konečné vakcíně představuje ve výrobě vakcíny nejvýše desátou subkulturu od matečného inokula, s nímž se provedly laboratorní a klinické zkoušky prokazující vhodnost kmene.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Do média pro počáteční buněčný růst se může přidat zvířecí sérum, ale udržovací médium při pomnožování viru neobsahuje žádné bílkoviny. Koncentrace séra v konečné vakcíně nepřesahuje jednu miliontinu. Médium může obsahovat vhodný indikátor pH, jako je červeň fenolová, a vhodná antibiotika v nejmenších účinných koncentracích.

Každá virová suspenze se zkouší na totožnost, bakteriální sterilitu a po neutralizaci specifickým antisérem také na nepřítomnost cizích virů. Virová suspenze se filtruje vhodným filtrem a může se koncentrovat a purifikovat. Suspenze má v mililitru obsahovat nejméně 1 . 10 7 CCID 50 každého typu viru.

Ve vhodnou dobu po poslední filtraci, nejlépe za 24 h, se přidají vhodné chemické látky, které inaktivují filtrovaný virus, aniž by poškodily jeho antigenitu. Při inaktivaci se provede vhodná filtrace, a je-li třeba, inaktivační látka se později neutralizuje.

Vhodnými zkouškami na buněčných kulturách se prokáže, že každá z monovalentních suspenzí je prostá infekčního poliomyelitického viru a jiných lidských a opičích virů. Trivalentní vakcína se připraví smícháním jednotlivých monovalentních suspenzí. Před přidáním jakékoliv protimikrobní konzervační látky se prokáže, že trivalentní suspenze je prosta infekčního poliomyelitického viru a jiných lidských a opičích virů.

Zkouška totožnosti

Podána vnímavým zvířatům podporuje vakcína tvorbu neutralizačních protilátek proti poliomyelitickému viru typu 1, typu 2 a typu 3.

Zkouška na čistotu

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Vakcína se zředí vhodným tlumivým roztokem dvacetkrát, stokrát a pětsetkrát. Ve skupinách po deseti třítýdenních kuřatech nebo deseti morčatech o hmotnosti 250 g až 350 g se nitrosvalově vstříkne každému zvířeti po 0,5 ml ředění vakcíny. Na každé ředění se použije jedna skupina zvířat. Pátý až šestý den po podání se zvířata vykrvácí a připraví se jednotlivá séra, která se ve zředění 1 : 4 vyšetří na přítomnost neutralizačních protilátek proti poliomyelitickým virům typu 1, typu 2 a typu 3.

Smíchá se 100 CCID 50 viru se zředěným sérem a inkubuje se 4 h 30 min až 6 h při 37 °C. Potom se nechá 12 h až 18 h stát při (5 ± 3) °C. Směsi se naočkují do buněčných kultur ke zjištění viru, který nebyl zneutralizován, a výsledky se odečtou za 7 dní po naočkování. Pro každou skupinu se zaznamenají počty sér s neutralizačními protilátkami a vypočítá se ředění vakcíny, které u 50 % zvířat poskytne protilátkovou odpověď.

Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže stonásobné nebo vyšší ředění vyvolá protilátkovou odpověď proti všem třem typům viru u 50 % zvířat.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Vaccinum poliomyelitidis perorale ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti poliomyelitidě perorální

Synonymum. Živá očkovací látka proti dětské obrně

Je to přípravek obsahující schválené kmeny živého oslabeného polyomyelitického viru typu 1, 2 nebo 3 pomnožené in vitro v kulturách schválených buněk. Obsahuje buď jeden typ, nebo kombinaci tří typů kmenů podle Sabina, upravených do formy vhodné pro perorální podání.

Je to čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Výroba

Vakcinační kmeny a výrobní postup prokazatelně poskytují stále stejné vakcíny, které jsou imunogenní a bezpečné pro člověka.

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Buněčné linie se používají podle systému buněčné banky. Při použití primárních buněk opičích ledvin vyhovuje výroba požadavkům dále uvedeným. Pokud není určeno a schváleno jinak, neprojde virus v konečném přípravku více než dvěma pasážemi od matečného inokula.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude přípravek zkoušen, vyhoví ve zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3), v kontinuálních buněčných liniích nebo v buňkách opičích ledvin. Kontinuální buněčné linie schvaluje oprávněná autorita.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky pro substrát pro pomnožení viru se vztahují na primární opičí buňky.

Opice použité pro přípravu kultur ledvinových buněk a pro zkoušení viru. Připravuje-li se vakcína v kulturách buněk opičích ledvin, jsou zvířata druhu schváleného oprávněnou autoritou zcela zdravá a nebyla dříve použita k žádným pokusům.

Opice se chovají v dobře postaveném zvěřinci s odpovídající ventilací v prostorných a oddělených klecích, umístěných co nejdále od sebe. Přijmou se odpovídající opatření k zabránění přenosu infekce mezi klecemi. Do jedné klece se umístí nejvýše dvě opice a obsazení klecí se nemění. V zemi výroby vakcíny se opice drží v karanténě nejméně 6 týdnů před použitím. Karanténní skupina je skupina vybraných zdravých opic chovaných v jedné místnosti se zvláštním režimem krmení a úklidu, která v karanténním období nemá styk s jinými opicemi. Když během karanténního období dojde k úhynu převyšujícímu 5 % v zásilce obsahující jednu nebo více skupin, opice z celé zásilky setrvávají v karanténě nejméně 6 dalších týdnů. Výjimkou je úhyn po nehodě, nebo tam, kde byla příčina specifikována, že není infekčním onemocněním. Jednotlivé skupiny se drží nepřetržitě v izolaci jako v karanténě, a to i po dokončení karanténního období, až do použití opic. Po odebrání poslední opice ze skupiny se místnost před použitím pro další skupinu vyčistí a dekontaminuje. Jestliže se použijí ledviny plodů, chovají se matky v karanténě po dobu březosti.

Opice, jejichž ledviny se mají vyjmout, se anestezují a pečlivě vyšetří na příznaky tuberkulózy a infekce cerkopitecidním herpesvirem 1 (B virus).

Jestliže opice vykazují nějaké patologické léze, závažné z hlediska použití jejich ledvin v přípravě inokula nebo vakcíny, nemohou se použít. Ani ostatní opice z karanténní skupiny se nemohou použít, pokud není zřejmé, že jejich použití neohrozí bezpečnost přípravku.

Všechny postupy uvedené v tomto oddíle se provádějí mimo objekt, v němž se vybírá vakcína.

Použité opice jsou prokazatelně bez protilátek proti viru SV 40 a viru opičí imunodeficience. Jestliže se pro výrobu použije druh Macaca, opice nemají prokazatelně ani protilátky proti cerkopitecidnímu herpesviru 1 (B virus). Jako indikátor nepřítomnosti protilátek proti viru B se používá lidský herpesvirus pro nebezpečí při zacházení s cerkopitecidním 1 virem (B virus).

Kultury buněk opičích ledvin pro výrobu vakcíny. Pro přípravu buněčných kultur se použijí pouze ledviny bez patologických známek. Jestliže jsou opice ze skupiny určené pro výrobu vakcíny, mohou se použít pro pomnožení viru sériově pasážované kultury buněk opičích ledvin z primárních buněk opičích ledvin, jinak se buňky opičích ledvin sériově nepasážují. Virus pro přípravu vakcíny se v takových kulturách pomnožuje asepticky. Pro růst buněk se může použít zvířecí sérum, po inokulaci viru se používá udržovací médium bez séra.

Každá skupina buněčných kultur připravených z jednotlivé opice nebo ze skupiny nejvýše deseti plodů se připravuje a zkouší samostatně.

Virové inokulum

Použité kmeny poliovirů jsou určeny podle průvodních záznamů, které obsahují informace o jejich původu a následné manipulaci s nimi.

Pracovní inokula se připraví jedinou pasáží z matečného inokula a ve schválené úrovni pasáží od originálního Sabinova viru. Inokula se připraví ve velkých množstvích a uchovávají se při teplotě nižší než -60 °C.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. Každé pracovní inokulum se identifikuje jako poliovirus daného typu za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Stanoví se dále popsanou metodou. Virová koncentrace je základ pro množství viru použitého ve zkoušce Neurovirulence.

Cizí agens (2.6.16). Jestliže je pracovní inokulum produkováno v lidských diploidních buňkách (5.2.3) nebo v kontinuální buněčné linii, vyhovuje požadavkům na inokulum pro virové vakcíny. Jestliže je pracovní inokulum produkováno v buňkách primárních opičích buněk, vyhovuje požadavkům dále uvedeným v odstavcích Pomnožování a sklizeň viru a Monovalentní spojená sklizeň a zkouškám na dospělých myších, sajících myších a na morčatech uvedeným ve stati Důkaz cizích agens v humánních virových vakcínách (2.6.16).

Neurovirulence (2.6.19). Každé matečné a pracovní inokulum vyhovuje zkoušce neurovirulence pro vakcínu proti poliomyelitidě (perorální). Nad to se zastaví používání pracovního inokula ve výrobě vakcíny, jestliže výskyt nedostatků z něho vyrobených monovalentních spojených sklizní je větší, než je předpovězeno statisticky. Referenční přípravky tří typů polioviru ze Sabinova originálu a dvou pasáží jsou k dosažení pro použití ve Světové zdravotnické organizaci, Ženeva, Švýcarsko.

Tato statistická předpověď se vypočítá po každé zkoušce na základě všech zkoušených monovalentních spojených sklizní; je stejná pravděpodobnost falešného odmítnutí v případě první zkoušky (tj. 1 %), pravděpodobnost falešného odmítnutí v případě nové zkoušky bývá zanedbatelná. Je-li tato zkouška prováděna pouze výrobcem, zkušební skla se poskytnou kontrolní autoritě k ohodnocení.

Genetické markery. Každé pracovní virové inokulum se zkouší na replikační vlastnosti při 36 °C až 40 °C, jak je popsáno v odstavci Monovalentní spojené sklizně.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí v aseptických podmínkách a v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do růstových médií se může použít schválené zvířecí sérum (ale ne lidské), avšak konečné udržovací médium pro buňky v době pomnožování viru neobsahuje zvířecí sérum. Sérum a trypsin použité k přípravě buněčných suspenzí a médií prokazatelně neobsahují živá cizí agens. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je červeň fenolová, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Přednostně se používá při výrobě substrát bez antibiotik. Nejméně 5 % a nejvýše 1000 ml buněčných kultur použitých při výrobě vakcíny se ponechává jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky); speciální požadavky, uvedené dále, se vztahují k výrobě vakcíny na primárních opičích buňkách. Virová suspenze se sklidí nejpozději 4 dny po inokulaci viru. Po inokulaci výrobní buněčné kultury pracovním inokulem se inokulované buňky udržují při stanovené teplotě, jež byla prokázána jako vhodná v rozmezí 33 °C až 35 °C. Teplota se udržuje neměnná, s odchylkou ±0,5 °C. Kontrolní buňky se inkubují při 33 °C až 35 °C po přiměřenou dobu inkubace.

Pouze sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě monovalentní spojené sklizně.

Koncentrace viru. Koncentrace viru ve virových sklizních se stanoví, jak je předepsáno v odstavci Stanovení účinnosti, ke sledování pravidelnosti výroby a k výpočtu ředění, které se použije do konečné várky vakcíny.

Cizí agens (2.6.16).

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky produkční buněčné kultury, ze které se sklízí virus, vyhovují ve zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16) nebo, při použití primárních opičích buněk, dále uvedenému.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky se vztahují k pomnožování viru v primárních opičích buňkách a k jeho sklizni.

Buněčné kultury. V den inokulace virovým inokulem se buněčné kultury vyšetří na degeneraci způsobenou infekčním agens. Jestliže se při prohlížení zjistí přítomnost cizího agens v některé buněčné kultuře, vyřadí se celá skupina kultur.

V den inokulace virovým pracovním inokulem se odebere vzorek nejméně 30 ml směsné tekutiny z buněčných kultur z ledvin z každé jednotlivé opice nebo ze skupiny nejvýše deseti opičích plodů. Vzorek se rozdělí na dvě části. Jedna část směsných tekutin se zkouší na kulturách buněk opičích ledvin připravených z téhož druhu, jaký se použil pro přípravu vakcíny, ale z jiného zvířete. Druhá část vzorku směsných tekutin se v případě nutnosti zkouší na kulturách buněk opičích ledvin z jiného druhu tak, aby alespoň jeden ze zkoušených vzorků byl zkoušen na kulturách buněk z opi c citlivých k viru SV40. Směsný vzorek se inokuluje do lahví s těmito buněčnými kulturami tak, aby ředění směsné tekutiny živným médiem nebylo vyšší než 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm 2 na mililitr směsné tekutiny. Nejméně jedna láhev každého druhu buněčné kultury zůstává bez inokulace a slouží jako kontrola. Jestliže je pro výrobu vakcíny použit druh opice, která je citlivá na SV40, zkouška na jiném druhu opice se nepožaduje. Pro pomnožování buněk se může použít zvířecí sérum za předpokladu, že neobsahuje protilátky proti SV40. Udržovací médium používané po inokulaci zkoušeného materiálu neobsáhuje sérum, s výjimkou dále uvedenou.

Buněčné kultury se inkubují při teplotě mezi 35 °C a 37 °C a pozorují se po celou dobu nejméně 4 týdnů. Během doby sledování a po nejméně 2 týdnech inkubace se z roztoku založí další subkultura na témže buněčném systému. Tyto subkultury se také pozorují nejméně 2 týdny.

Při pasážování subkultur se na původní kultury může přidat sérum, pokud toto sérum neobsahuj e protilátky proti SV40.

Pro detekci viru SV40 a ostatních virů v buňkách mohou být užitečné techniky využívající fluorescenční protilátky.

Další vzorek nejméně 10 ml směsné tekutiny se zkouší na přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus) a na přítomnost ostatních virů v kulturách buněk králičích ledvin. Sérum používané v růstovém médiu pro tyto kultury má být prokazatelně prosté inhibitorů viru B. Jako indikátor nepřítomnosti inhibitorů viru B se používá lidský herpesvirus pro nebezpečí při zacházení s cerkopitecidním herpesvirem 1 (B virem). Vzorek se inokuluje do láhví s těmito buněčnými kulturami tak, aby ředění směsné tekutiny růstovým médiem nebylo vyšší než 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm 2 na mililitr směsné tekutiny. Nejméně jedna láhev buněčné kultury zůstává bez inokulace a slouží jako kontrola.

Kultury se inkubují při 35 °C až 37 °C a pozorují se nejméně 2 týdny.

Další vzorek 10 ml směsné tekutiny se z buněčné kultury přemístí v den inokulace virovým inokulem a zkouší se na přítomnost cizích agens inokulaci na lidské buněčné kultury citlivé na virus spalniček.

Tyto zkoušky lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejvýše 20 % lahví s kulturami bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody do konce vlastní zkušební doby.

Jestliže se při těchto zkouškách najde důkaz přítomnosti nějakého cizího agens, je jednotlivá sklizeň ze skupiny buněčných kultur vyřazena.

Jestliže se prokáže přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus), výroba perorální vakcíny proti poliomyelitidě se přeruší a informuje se oprávněná autorita. Výroba se neobnoví, dokud se neuzavře vyšetřování a nepřijmou se opatření proti jakémukoliv znovuobjevení infekce. Obnovení výroby schválí oprávněná autorita.

Jestliže tyto zkoušky nejsou prováděny bezprostředně, vzorky směsné tekutiny z kultur se uchovávají při teplotách 60 °C nebo nižších teplotách, s výjimkou vzorku pro zkoušku na B virus, který se uchovává při 4 °C po dobu nejvýše 7 dní po odběru.

Kontrolní buněčné kultury. V den inokulace virovým pracovním inokulem se 25 % (ale nejvýše 2,5 l) buněčné suspenze pocházející z ledvin jednotlivých opic nebo z nejvýše deseti plodů opic ponechá jako neinokulované kontrolní buněčné kultury. Tyto kontrolní buněčné kultury se kultivují nejméně 2 týdny za stejných podmínek jako kultury inokulované a během této doby se vyšetřuj í na výskyt cytopatických změn. Zkoušky lze hodnotit, jestliže nejvýše 20 % kontrolních buněčných kultur bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody.

Na konci doby sledování se kontrolní buňky vyšetří na degeneraci způsobenou nějakým infekčním agens. Jestliže toto vyšetření nebo některá ze zkoušek požadovaných v tomto odstavci prokáže v kontrolní kultuře známky přítomnosti nějakého cizího agens, vyřadí se poliovirus rostoucí na inokulovaných kulturách z této skupiny.

Zkoušky na hemadsorbující viry. V době sklizně viru nebo 4 dny po inokulaci výrobních kultur virovým pracovním inokulem se odebere vzorek o velikosti 4 % kontrolních buněčných kultur a zkouší se na hemadsorbující viry. Na konci sledovaného období se podobně zkoušejí zbývající buněčné kultury. Tyto zkoušky se provádějí, jak je popsáno ve stati Důkaz cizích agens v lidských virových vakcínách (2.6.16).

Zkoušky na ostatní cizí agens. V době sklizně nebo 7 dní po inokulaci výrobních kultur virovým pracovním inokulem se odebere vzorek nejméně 20 ml směsné tekutiny z každé skupiny kontrolních kultur a zkouší se na dvou druzích buněčných kultur opičích ledvin, jak je popsáno výše.

Na konci doby pozorování původních kontrolních buněčných kultur se odeberou obdobné vzorky směsných tekutin a opakují se zkoušky vztahující se k této skupině na dvou druzích buněk opičích ledvin a na kulturách králičích buněk, jak je výše popsáno v odstavci Buněčné kultury.

Jestliže se prokáže přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (virus B), výrobní buněčná kultura se nepoužije a provedou se výše popsaná opatření týkající se výroby vakcíny.

Tekutiny odebrané z kontrolních buněčných kultur v době sklizně viru a na konci doby pozorování se před zkouškou na cizí agens mohou smísit. Vzorek 2 % směsné tekutiny se zkouší v každém specifikovaném systému buněčných kultur.

Jednotlivé sklizně.

Zkoušky neutralizovaných jednotlivých sklizní na buněčných kulturách opičích ledvin. Vzorek nejméně o velikosti 10 ml z každé jednotlivé sklizně se neutralizuje typově specifickým antisérem proti poliomyelitidě připraveným z jiných zvířat, než jsou opice. Při přípravě antiséra pro tento účel se imunizační antigeny připraví v jiných buňkách než opičích.

Polovina neutralizované suspenze (odpovídající nejméně 5 ml jednotlivé sklizně) se zkouší na kulturách buněk opičích ledvin připravených z téhož druhu, ale ne ze stejného zvířete, jaký se použil pro výrobu vakcíny. Druhá polovina neutralizované suspenze se zkouší, je-li třeba na buněčných kulturách opičích ledvin jiného druhu tak, že se provedou zkoušky neutralizované suspenze na buněčných kulturách z nejméně jednoho druhu, o němž je známo, že je citlivý na SV40.

Neutralizované suspenze se inokulují do lahví s těmito buněčnými kulturami takovým způsobem, aby ředění suspenze v růstovém médiu nepřesáhlo poměr 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm 2 na mililitr neutralizované suspenze. Nejméně jedna láhev každého typu buněčné kultury zůstane neinokulovaná a slouží jako kontrola a je udržována růstovým médiem obsahujícím stejnou koncentraci specifického antiséra použitého k neutralizaci.

Pro růst buněk se může použít zvířecí sérum, pokud toto sérum neobsahuje protilátky proti SV40. Udržovací médium, používané po inokulaci zkoušeného materiálu, neobsahuje žádné sérum kromě antiséra neutralizujícího poliovirus, s výjimkou dále popsanou.

Kultury se inkubují při teplotě 35 °C až 37 °C a pozorují se po celou dobu nejméně 4 týdnů. Během doby pozorování a po nejméně 2 týdnech inkubace se založí nejméně jedna subkultura z tekutiny z každé kultury na témže systému buněčné kultury. Subkultury se také pozorují nejméně 2 týdny. Sérum se může přidat k původním kulturám v době založení subkultury, pokud neobsahuj e protilátky proti SV40.

Na dalším vzorku z neutralizovaných jednotlivých sklizní se provedou další zkoušky na cizí viry inokulací 10 ml na kultury lidských buněk citlivých na virus spalniček.

Pro detekci viru SV40 a ostatních virů v buňkách mohou být užitečné techniky využívající fluorescenčních protilátek.

Tyto zkoušky lze hodnotit, jestliže nejvýše 20 % nádob s kulturami bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody do konce vlastní zkušební doby.

Když se objeví cytopatické změny v některé z kultur, příčiny těchto změn se vyšetří. Jestliže se prokáže, že cytopatické změny způsobil nezneutralizovaný poliovirus, zkouška se opakuje.

Projeví-li se známky přítomnosti SV40 nebo jiného cizího agens v jednotlivé sklizni, tato sklizeň se vyřadí.

Monovalentní spojená sklizeň

Monovalentní spojená sklizeň se připraví smícháním počtu vyhovujících jednotlivých sklizní téhož typu viru. Monovalentní spojené sklizně z kontinuálních buněčných linií se mohou purifíkovat. Každá monovalentní spojená sklizeň se filtruje filtrem zadržujícím bakterie.

Pouze monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Každá monovalentní spojená sklizeň se za použití specifických protilátek prokáže jako poliovirus daného typu.

Koncentrace viru. Koncentrace viru se stanoví dále popsanou metodou a slouží jako základ pro výpočet ředění přípravku v konečné várce, pro množství viru použitého ve zkoušce neurovirulence a ke sledování pravidelnosti výroby.

Neurovirulence (2.6.19). Každá monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce neurovirulence pro vakcínu proti poliomyelitidě (perorální). Je-li tato zkouška prováděna pouze výrobcem, poskytnou se zkušební skla také oprávněné autoritě k hodnocení.

Genetické markery. Poměr replikačních kapacit viru v monovalentní spojené sklizni se získá při teplotě v rozmezí mezi 36 °C a 40 °C ve srovnání s inokulem nebo referenčním přípravkem pro markerové zkoušky a s vhodnými rct/40- a rct/40+ kmeny polioviru téhož typu. Inkubační teploty užívané v této zkoušce se řídí v rozmezí ±0,1 °C. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje této zkoušce, jestliže titr viru ze sklizně a vhodného referenčního materiálu je při 36 °C nejméně o 5,0 log vyšší než titr stanovený při 40 °C. Je-li růst při 40 °C tak nízký, že validní srovnání nelze provést, použije se teplota v rozmezí 39,0 °C až 39,5 °C. Při této teplotě je snížení titru referenčního materiálu v rozmezí od 3,0 log do 5,0 log proti hodnotě při 36 °C. Přijatelná minimální redukce se pro každý kmen viru stanoví při dané teplotě. Jestliže titry získané pro jeden nebo více referenčních virů nejsou ve shodě s očekávanými hodnotami, zkouška se opakuje.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky platí pro monovalentní spojené sklizně odvozené z primárních opičích buněk.

Zkoušky na králících. Vzorek monovalentní spojené sklizně se zkouší na přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus) a ostatní viry vstříknutím nejméně 100 ml nejméně deseti zdravým králíkům hmotnosti 1,5 kg až 2,5 kg. Každý králík dostane nejméně 10 ml a nejvýše 20 ml, přičemž 1 ml je podán intradermálně na několik míst a zbytek subkutánně. Králíci se pozorují nejméně 3 týdny, sleduje se úhyn a známky onemocnění.

Všichni králíci, kteří uhynuli po prvních 24 h zkoušky a vykazují známky onemocnění, se pitvají a vyjme se jim mozek a orgány k podrobnému vyšetření pro zjištění příčiny úhynu.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejvýše 20 % inokulovaných králíků vykazuje známky interkurentní infekce během doby pozorování. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce, jestliže žádný z králíků nemá známky infekce virem B nebo ostatními cizími agens nebo léze jakéhokoliv druhu, jež lze přisoudit suspenzi várky.

Při průkazu přítomnosti viru B se provedou opatření týkající se výroby vakcíny uvedená výše v odstavci Buněčné kultury.

Zkouška na morčatech. Nejméně pěti morčatům, každému o hmotnosti 350 g až 450 g, se podá 0,1 ml monovalentní spojené sklizně intracerebrálně a 0,5 ml intraperitoneálně. Po 6 týdnů se každý pracovní den měří rektálně teplota každému zvířeti. Na konci doby pozorování se provede pitva každého zvířete.

Kromě toho se nejméně pěti morčatům intraperitoneálně podá 0,5 ml a 2 až 3 týdny se pozorují, jak je popsáno výše. Na konci doby pozorování se provede pasáž krve a suspenze jaterní nebo slezinné tkáně nejméně dalším pěti morčatům. Těmto morčatům se po dobu 2 až 3 týdnů měří rektálně teplota. Jestliže dojde po prvním dni k úhynu nebo jsou zvířata utracena pro příznaky onemocnění, provede se pitva. Pitva se provede také v případě, že vykazují po tři za sebou následující dny teplotu vyšší než 39 °C; provede se histologické vyšetření k detekci viru Marburg; navíc se intraperitoneálně podá suspenze jaterní nebo slezinné tkáně nebo krve nejméně třem dalším morčatům. Jestliže se zjistí jakékoliv příznaky infekce virem Marburg, provede se konfirmační sérologický test z krve postižených zvířat. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce, jestliže nejméně 80 % morčat přežívá do konce doby pozorování v dobrém zdravotním stavu a žádné zvíře nemá příznaky infekce virem Marburg.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více vyhovujících monovalentních spojených sklizní a může obsahovat více než jeden typ viru. Mohou se přidat vhodné ochucující látky a stabilizátory.

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1); na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje následujícímu požadavku na teplotní stabilitu a vyhovuje všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití.

Teplotní stabilita. Vzorky z šarže se 48 h uchovávají při 37 °C. Stanoví se celková koncentrace viru, jak je popsáno v odstavci Stanovení účinnosti, současně ve vzorkách vystavených vyšší teplotě a ve vzorkách nezahřáté vakcíny. Stanovený rozdíl mezi celkovou virovou koncentrací zahřáté a nezahřáté vakcíny není vyšší než 0,5 log 10 infekční virové jednotky (CCID 50 ) na jednu lidskou dávku.

Zkouška totožnosti

Použitím specifických protilátek se prokáže, že vakcína obsahuje poliovirus každého typu uvedeného v označení na obalu.

Zkouška na čistotu

Bakterie a houby. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Stanovení účinnosti

Titrace infekčního viru se provádí nejméně trojmo za použití metody dále popsané. K validaci každého stanovení se používá vhodný referenční virus. Jestliže vakcína obsahuje více než jeden typ polioviru, titruje se každý typ odděleně za neutralizace ostatních přítomných typů vhodnými specifickými antiséry (nebo přednostně monoklonálními protilátkami).

Pro trivalentní vakcínu jsou stanoveny tyto dolní titry virů: nejméně 1 . 10 6,0 infekčních virových jednotek (CCID 50 ) v jednotlivé lidské dávce pro typ 1; nejméně 1 . 105,0 infekčních virových jednotek (CCID 50 ) pro typ 2; nejméně 1 . 10 5,5 infekčních virových jednotek (CCID 50 ) pro typ 3.

Pro monovalentní a divalentní vakcínu rozhodne o výši minimálního titru oprávněná autorita.

Metoda. Skupiny osmi až dvanácti jamek s plochým dnem na mikrotitrační destičce se inokulují 0,1 ml každého vybraného ředění viru a následně se přidá vhodná suspenze buněk linie Hep-2 (Cincinnati). Destičky se inkubují ve vhodné teplotě. Kultury se vyšetřují v 7. až 9. dnu. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95 ) logaritmu virové koncentrace je nejvýše ±0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- typy polioviru obsažené ve vakcíně,

- minimální množství viru každého typu obsažené v jedné lidské dávce,

- buněčný substrát použitý pro výrobu vakcíny,

- že se vakcína nevstřikuje.

Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti pseudomoru ptáků

Synonymum. Inaktivovaná vakcína proti Newcastleské chorobě

Je to emulze nebo suspenze vhodného kmene viru pseudomoru ptáků inaktivovaného takovým způsobem, který zachová jeho imunogenní účinnost. Vakcína může obsahovat olejové nebo jiné vhodné adjuvans.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží v kuřecích embryích pocházejících ze zdravých chovů nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4).

Zkouška na pomnožení reziduálních živých virů se provádí při sklizni meziproduktu těsně před přidáním adjuvans, aby potvrdila inaktivaci viru. Zkouška se provádí na kuřecích embryích nebo ve vhodné buněčné kultuře a použité množství inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Nezjistí se žádný živý virus.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti a imunogenity pro všechny druhy a kategorie ptáků, pro které je určena. K průkazu účinnosti (5.2.7) se může použít následující zkouška.

Imunogenita. Pro domácí drůbež je k prokázání imunogenity vhodná zkouška s virulentní čelenží (zkouška B) popsaná v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkouška totožnosti

Podána vnímavým zvířatům podporuje vakcína tvorbu protilátek proti viru pseudomoru ptáků (ptačí paramyxovirus typ I).

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Pokud je vakcína určena pro domácí drůbež, podá se deseti kuřatům z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Pokud vakcína není určena pro domácí drůbež, podává se deseti zdravým ptákům toho druhu, pro který je určena. Podají se dvě dávky vakcíny jedním z doporučených způsobů podání každému z deseti ptáků starých 14 dní až 28 dní. Doba pozorování je 21 dnů. Neobjeví se žádné abnormální místní ani systémové reakce.

Inaktivace. Deseti kuřecím embryím z chovu prostého specifikovaných patogenů (SPF vejce) (5.2.2) a starých 9 dní až 11 dní se do alantoidní dutiny vstříkne po dvou pětinách dávky a nechají se inkubovat. Pozorují se 6 dnů, pak se odděleně shromáždí alantoidní tekutina z vajec obsahujících živá embrya a z vajec obsahujících mrtvá embrya, z nichž se vyřadí ta, která uhynula do 24 h po injekci. Embrya, která uhynula do 24 h po injekci, se zkouší na přítomnost viru pseudomoru ptáků. Vakcína nevyhovuje, pokud je tento virus zjištěn.

Do alantoidní dutiny každého z deseti 9 dnů až 11 dnů starých SPF vajec se vstříkne po 0,2 ml spojené alantoidní tekutiny z vajec se živými embryi a do každého z dalších deseti SPF vajec 0,2 ml spojené tekutiny z vajec s uhynulými embryi, inkubuje se 5 až 6 dnů. Alantoidní tekutina z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutininů za použití kuřecích erytrocytů.

Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže nejsou přítomny známky hemaglutinační aktivity a jestliže neuhyne více než 20 % embryí v jedné ze skupin. Pokud v jedné ze skupin uhyne více než 20 % embryí, opakuje se zkouška v této skupině. Nezjistí se hemaglutinační aktivita a nejvýše 20 % embryí ve skupině smí uhynout.

K vyloučení bakteriální infekce se mohou v této zkoušce použít antibiotika.

Cizí agens. Každému z deseti kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů a 14 až 28 dnů starých se jedním z doporučených způsobů podají dvě dávky. Po třech týdnech se každému kuřeti doporučeným způsobem podá jedna dávka. Po dvou týdnech se získají vzorky sér od každého kuřete a provedou se zkoušky na přítomnost protilátek proti sledovaným agens metodami předepsanými pro chovy prosté specifikovaných patogenů, které se používají pro výrobu a kontrolu kvality vakcín (5.2.2): virus ptačí encefalomyelitidy, virus ptačí infekční bronchitidy, virus ptačí leukózy, hemaglutinační ptačí adenovirus, virus infekční burzitidy, virus infekční laryngotracheitidy, virus chřipky A, virus Markovy choroby. Vakcína nevyvolá tvorbu protilátek proti těmto virům.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

A. Každému z nejméně deseti kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů a 21 až 28 dnů starých se vstříkne intramuskulárně objem vakcíny odpovídající 1/50 dávky. Za 17 až 21 dnů se odeberou vzorky séra od každého vakcinovaného kuřete a od každého z deseti kontrolních kuřat stejného věku a stejného původu. Hladina protilátek v jednotlivých sérech se měří dále popsanou hemaglutinačně-inhibiční zkouškou (HI) nebo rovnocennou metodou se stejným počtem hemaglutinačních jednotek a množstvím erytrocytů a s pozitivním kontrolním sérem kalibrovaným podle mezinárodního referenčního přípravku séra proti pseudomoru ptáků. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže průměrný HI titr vakcinované skupiny je stejný nebo větší než 4 log 2 a titr u nevakcinované skupiny je 2 log nebo méně. Jestliže HI titry nejsou uspokojivé, provede se zkouška B.

Hemaglutinačně-inhibični zkouška. Zkoušená séra se 30 min inaktivují zahřátím na 56 °C. Do první řady jamek mikrotitrační destičky se odpipetuje po 0,05 ml inaktivovaných sér a do ostatních jamek se odpipetuje 0,50 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l) o pH 7,2 až 7,4. Připraví se dvojnásobné ředění séra po celé destičce. Do každé jamky se přidá 0,05 ml suspenze obsahující 4 hemaglutinační jednotky inaktivovaného viru pseudomoru ptáků. Destičky se 1 h inkubují při 4 °C, přidá se 0,05 ml 1% suspenze červených krvinek získaných ze 3- až 4týdenních kuřat vnímavých k pseudomoru ptáků. Destičky se 1 h inkubují při 4 °C. Ve zkoušce se použijí jak pozitivní, tak negativní séra. Pozitivní kontrolní sérum má titr 300 m.j. až 400 m.j. stanovených kalibrací na mezinárodní referenční přípravek a HI titr 5 log 2 až 6 log 2 stanovený v použitém zkušebním systému.

B. Použijí se kuřata z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) a stará 21 až 28 dnů. Pro vakcinaci se použijí nejméně tři skupiny, v každé nejméně dvacet kuřat; deset kuřat se ponechá jako kontrolní skupina. Vybere se takový počet různých objemů vakcíny, jaký je počet skupin: například objemy odpovídající 1/25, 1/50,1/100 dávky. Každé skupině se podá odlišný objem. Každému kuřeti se intramuskulárně podá objem zvolený pro danou skupinu. Za 17 až 21 dnů se všem kuřatům podá intramuskulární injekce o obsahu 6 log 10 embryonální LD 50 viru pseudomoru ptáků kmene - Herts (Weybridge 33/56). (Embryonální LD 50 aplikovaného kmene se stanoví sledováním embryí po dobu 6 dnů.) Kuřata se sledují 21 dnů. Z počtu kuřat, které přežijí 21 dní v každé vakcinační skupině bez klinických známek onemocnění Newcastleskou chorobou, se vypočítá PD 50 standardními statistickými metodami. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže nejmenší dávka uvedená na označení vakcíny odpovídá nejméně 50 PD 50 a spodní hranice spolehlivosti je nejméně 35 PD 50 na dávku. Je-li tento limit méně než 35 PD 50 na dávku, zkouška se opakuje. Vakcína v opakované zkoušce obsahuje nejméně 50 PD 50 . Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, pokud všechna kuřata v kontrolní skupině uhynou během 6 dnů po čelenži.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- druh a třída ptáků, pro které je vakcína určena,

- kmen viru, který byl použit pro výrobu.

Vaccinum pseudopestis aviariae vivum cryodesiccatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti pseudomoru ptáků lyofilizovaná

Synonymum. Živá vakcína proti Newcastleské chorobě

Je to přípravek lentogenního kmene viru pseudomoru.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží v alantoidní dutině kuřecích embryí z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Jsou-li buněčné kultury ptačího původu, jsou získány z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2). Virové suspenze se shromáždí, smíchají s vhodnou stabilizující tekutinou a lyofilizují.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu vakcíny se může použít pouze kmen, který je prokazatelně imunogenní a jehož index neurovirulence není vyšší než 0,5. Při průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Index neurovirulence. Vzorek inokula, je-li třeba rekonstituovaný, se vstříkne do alantoidní dutiny kuřecích embryí 9 až 11 dní starých pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Vejce se inkubuje 2 dny, potom se sklidí alantoidní tekutiny. Každému z nejméně deseti jednodenních (to je více než 24 h, ale méně než 40 h po vylíhnutí) vnímavých kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů se intracerebrálně vstříkne 0,05 ml alantoidní tekutiny obsahující množství viru odpovídající nejméně 10 8 EID 50 . Kuřata se pozorují 8 dnů a každý den se zaznamenává počet zdravých, počet vykazujících příznaky onemocnění a počet uhynulých. Všechny tři soubory se sečtou. Celkový součet zdravých se násobí nulou, celkový počet vykazujících příznaky onemocnění se násobí 1 a celkový počet úhynů se násobí 2. Index neurovirulence se získá, když se součet tří předchozích součinů dělí součtem počtu zdravých, nemocných a uhynulých zvířat.

Imunogenita. K prokázání imunogenity je vhodná zkouška, která je popsána v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušení šarže

Pokud byly zkouška na viry ptačí leukózy a zkoušky na cizí viry na buněčných kulturách a kuřecích embryích provedeny na reprezentativní šarži vakcíny s vyhovujícími výsledky, mohou být tyto zkoušky při rutinních kontrolách jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěny, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených ze stejného inokula vypuštěna, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Rekonstituovaná vakcína smísená s monospecifickým antisérem již nevyvolá hemaglutinaci vhodné koncentrace kuřecích erytrocytů nebo již neinfikuje vnímavá kuřecí embrya, ve stáří 9 až 11 dnů, nebo vnímavé buněčné kultury, do nichž je inokulována.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) a nejnižšího stáří, které je pro vakcinaci uvedeno v označení. Každému kuřeti se nakape do oka deset dávek vakcíny rekonstituované tak, aby se získala koncentrace vhodná pro zkoušku. Kuřata se pozorují 21 dnů. U vakcín určených k vakcinaci kuřat starých dva týdny nebo více se použijí kuřata inokulovaná ve zkoušce na cizí antigeny. Jestliže v období pozorování uhyne více než dvě kuřata z příčin, které nelze přisoudit vakcíně, zkouška se opakuje. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže žádné z kuřat nemá vážné klinické příznaky, zvláště příznaky dýchací, a žádné z kuřat neuhyne z příčin, které lze přisoudit vakcíně.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na leukózní viry.

Cizí viry při použití buněčných kultur (2.6.5). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití buněčných kultur.

Cizí viry při použití kuřecích embryí (2.6.3). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití kuřecích embryí.

Cizí antigeny (2.6.6). Vakcína vyhovuje zkoušce na cizí antigeny při použití kuřat.

Bakterie a houby. Provede se kvantitativní zkouška na bakterie a houby. Vakcína neobsahuje více než jeden saprofytický mikroorganismus v dávce a je prosta patogenních mikroorganismů. Vakcíny určené pro parenterální podání a tekutiny s nimi dodávané vyhovují zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Rekonstituovaná vakcína se titruje v buněčných kulturách nebo inokulací do alantoidní dutiny kuřecích embryí starých 9 až 11 dnů. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá kuřata z jednoho chovu prostého specifikovaných patogenů a nejnižšího stáří, které je pro vakcinaci uvedeno v označení. Každému z nejméně dvaceti kuřat pro každý z udávaných způsobů podání se podá takový objem rekonstituované vakcíny, který obsahuje množství viru, jež odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení. Pro kontrolu se použije deset kuřat. Po 14 až 21 dnech se každé kuře čelenžuje intramuskulárně 10 5 LD 50 virulentního kmene viru pseudomoru ptáků. Zvířata se pozorují 10 dnů. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže na konci doby pozorování nejméně 90 % vakcinovaných kuřat přežívá a nejeví příznaky onemocnění a všechna kontrolní kuřata uhynula do 6 dnů po inokulaci virulentním čelenžním kmenem.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede stáří zvířat, jež se mají vakcinovat.

Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum ⟪MEDIA:img_001⟫

Humánní vakcína proti vzteklině připravená v buněčných kulturách

Je to lyofilizovaný přípravek vhodného stabilního kmene viru vztekliny pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou.

Vakcína se rozpustí bezprostředně před použitím podle návodu, vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Vakcína vyhovuje požadavkům článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu. Jestliže není stanoveno oprávněnou autoritou jinak, virus v konečné vakcíně neprojde více pasážemi od matečného inokula než virus vakcíny, která vyhověla v klinické zkoušce na neškodnost a účinnost: dokonce podle autorizované výjimky počet pasáží pro klinickou studii nepřesáhne pět.

Výrobní metoda se validuje, aby se dokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnoží v buňkách lidské diploidní linie (5.2.3), v kontinuální linii schválené oprávněnou autoritou nebo v buňkách kuřecích embryí odvozených z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Inokula

Použitý kmen viru je identifikován záznamy, včetně informace o původu kmene a následné manipulaci s ním.

Pracovní inokulum se připraví nejvýše pěti pasážemi od matečného inokula. Jen takové pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro pomnožování viru.

Totožnost. Každé pracovní inokulum se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Aby se zajistila stejnorodost výroby, stanoví se virová koncentrace v každém pracovním inokulu metodou buněčné kultury za použití imunofluorescence.

Cizí agens (2.6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům na virová inokula. Je-li virus pasážován na myších mozcích, provedou se specifické zkoušky na myší viry.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami probíhají za aseptických podmínek v prostoru, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do médií se může použít schválené sérum živočišného, nikoli humánního původu, ale konečné udržovací médium pro buněčný růst při pomnožování viru neobsahuje živočišné sérum: média mohou obsahovat lidský albumin vyhovující článku Albumini humani solutio. Sérum a trypsin použité pro přípravu buněčné suspenze a médií prokazatelně neobsahují infekční cizí agens: trypsin vyhovuje článku Trypsinům. Média pro buněčnou kulturu mohou obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky). Virová suspenze se sklízí jednou nebo vícekrát během inkubace. Více sklizní z téže produkční buněčné kultury se může spojit a považovat za jednu sklizeň. Jen taková jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu inaktivované virové sklizně.

Totožnost. Jednotlivá sklizeň obsahuje virus, který se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Infekční virus se stanoví na buněčných kulturách: titrem se sleduje stejnoměrnost výroby.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z produkční buněčné kultury, z níž se odvozují jednotlivé sklizně, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Purifikace a inaktivace

Virová sklizeň se může koncentrovat a případně též purifikovat vhodnými metodami: virová sklizeň se inaktivuje validovanou metodou v pevně definovaném stadiu výroby, které může být před, během nebo po koncentraci nebo purifikaci. Metoda je prokazatelně schopna inaktivovat rabický virus bez zničení imunogenní aktivity. Při použití betapropiolaktonu nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli 1 : 3500.

Pro přípravu konečné várky vakcíny se použije jen taková inaktivovaná virová suspenze, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na zbytkový infekční rabický virus buďto ihned po inaktivaci, nebo se použije vzorek zmražený bezprostředně po inaktivaci a uchovávaný při -70 °C. Naočkuje se takové množství inaktivované virové suspenze, které odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny na buněčnou kulturu téhož typu, jaký byl použit pro výrobu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Jestliže se pro pomnožování viru použije kontinuální buněčná linie, stanoví se obsah zbytkové DNK hostitelských buněk vhodnou metodou, jak je uvedeno v článku Producta ab ADN recombinante, a není větší než 100 pg v jedné lidské dávce.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných virových suspenzí. Může se přidat schválený stabilizátor k uchování účinnosti přípravku při lyofilizaci a po ní.

K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Obsah glykoproteinu. Vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) se stanoví obsah glykoproteinu, např. jednoduchou radiální imunodifuzí, metodou ELISA nebo Zkouškou vazby protilátek. Obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou živnou půdu použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních obalů a lyofilizuje až do obsahu vlhkosti, který zaručuje optimální stabilitu přípravku. Obaly se uzavírají tak, aby se vyloučila kontaminace a pronikání vlhkosti.

K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti. Za předpokladu, že zkouška na inaktivaci byla provedena v inaktivované virové suspenzi s vyhovujícím výsledkem a zkouška na bovinní sérumalbumin v konečné várce s vyhovujícím výsledkem, mohou být tyto zkoušky vynechány u šarže.

Zkouška totožnosti

Přítomnost antigenu rabického viru se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití protilátek, nejlépe mnonoklonálních. Vedle toho také stanovení účinnosti slouží jako zkouška totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Inaktivace. Množství odpovídající nejméně dvaceti pěti lidským dávkám vakcíny se naočkuje na buněčnou kulturu téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce. Obsah se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. v jedné lidské dávce.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vakcína vyhovuje ve zkoušce na pyrogenní látky, při níž se, pokud není stanoveno jinak, vstříkne každému králíkovi jedna lidská dávka desetkrát zředěná.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší proti účinku letální dávky rabického viru intracerebrálně podané s množstvím referenčního přípravku nezbytným k vytvoření stejné ochrany. Pro toto porovnání je zapotřebí referenční vakcína kalibrovaná v mezinárodních jednotkách a vhodný rabický virus používaný jako čelenžní přípravek.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Dále uvedená zkouška používá rovnoběžný model s nejméně třemi body pro zkoušený přípravek i pro referenční přípravek. Pouze pracovník se zkušenostmi s touto metodou podání je oprávněn provádět zjednodušenou zkoušku s jedním ředěním zkoušeného přípravku. Taková zkouška dovoluje pracovníkovi určit, že vakcína má účinnost signifikantně vyšší, než je požadované minimum, ale nedává plnou informaci o validitě každého jednotlivého stanovení účinnosti. Užití jednoho ředění dovoluje značnou redukci počtu zvířat předepsaných pro zkoušku a je zvažováno každou laboratoří ve vztahu k ustanovením Evropské konvence pro ochranu obratlovců používaných pro vědecké a jiné experimentální účely.

Výběr a rozložení zkušebních zvířat. Používají se zdravé samičky myší staré asi 4 týdny hmotnosti 11 g až 15 g a pocházející z jednoho chovu. Myši se rozdělí do šesti skupin o tolika zvířatech, aby byly splněny požadavky na validitu zkoušky. Pro titraci čelenžní suspenze se rozdělí do čtyř skupin po pěti.

Příprava čelenžní suspenze. Myším se intracerebrálně vstříkne kmen CVS rabického viru, a když myši vykazují známky onemocnění, ale před jejich úhynem, se usmrtí, vyjmou se mozky a připraví se homogenát mozkové tkáně ve vhodném ředidle. Větší částice se oddělí odstředěním a supernatant se použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se suspenzí se rozmrazí, vhodným ředidlem se připraví sériová ředění. Každé ředění se intracerebrálně vstříkne skupině pěti myší po 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují po dobu 14 dnů. Hodnota LD 50 neředěné suspenze se vypočítá z počtu zvířat v každé skupině, která vykazují známky onemocnění nebo uhynula mezi pátým a čtrnáctým dnem.

Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Připraví se tři pětinásobná sériová ředění zkoušeného přípravku a tři pětinásobná sériová ředění referenčního přípravku. Připraví se ředění tak, že u nejkoncentrovanějšího ředění lze očekávat, že ochrání více než 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a u nejméně koncentrovaných ředění lze očekávat ochranu nižší než 50 % u zvířat, kterým bylo toto ředění podáno. Každé ze šesti ředění se podá jedné ze šesti šestnáctičlenných skupin zvířat a každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml toho ředění, které bylo přiděleno skupině. Po sedmi dnech se připraví tři identická ředění zkoušeného přípravku a referenčního přípravku a injekce se opakuje. Sedm dní po druhé injekci se připraví na základě předchozí titrace taková suspenze čelenžního viru, aby 0,03 ml obsahovalo 50 LD 50 . Intracerebrálně se každé vakcinované myši vstříkne 0,03 ml této suspenze. Připraví se tři vhodná sériová ředění čelenžní suspenze a suspenze a ředění se přičlení ke čtyřem skupinám po deseti zvířatech. Čelenžní suspenze a tři ředění se intracerebrálně vstříknou čtyřem skupinám myší po 0,03 ml. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní a zaznamenávají se počty zvířat vykazujících známky onemocnění vzteklinou nebo uhynulých v období od pátého do čtrnáctého dne po čelenži.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže 50% ochranná dávka referenčního přípravku i zkoušeného přípravku leží mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myši; jestliže titrace čelenžní suspenze prokáže, že 0,03 ml čelenžní suspenze obsahuje nejméně 10 LD 50 jestliže statistická analýza vykazuje signifikantní sklon a nesignifikantní odchylku linearity nebo rovnoběžnosti v závislosti dávka - odpověď; jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti.

Vakcína vyhovuje, jestliže stanovená účinnost je nejméně 2,5 m.j. v lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede biologický původ buněk použitých k přípravě vakcíny.

Vaccinum rabiei inactivatum ad usum veterinarium ⟪MEDIA:img_001⟫

Inaktivovaná vakcína proti vzteklině pro veterinární použití

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek z fixního viru vztekliny inaktivovaný vhodným způsobem. Virus se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře nebo v jiných vhodných substrátech a může se purifikovat a koncentrovat. Vakcína může obsahovat adjuvans a vhodnou protimikrobní konzervační látku.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vakcíny z tkáňových kultur se připravují pomnožením viru v primárních buněčných kulturách ze zdravých zvířat nebo ve vhodných buněčných liniích (5.2.4). Virová suspenze se sklízí jedenkrát nebo vícekrát během 28 dní po naočkování. Vícenásobné sklizně z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň. Virus vztekliny se inaktivuje vhodnou metodou.

U vakcín z buněčných kultur se na buněčných kulturách stejného druhu, jaké byly použity při výrobě vakcíny, provede zkouška na zbytkový infekční virus vztekliny, aby se potvrdila účinná inaktivace viru vztekliny. Množství inaktivovaného viru pro tuto zkoušku odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny. Nezjistí se živý virus.

Účinnost reprezentativní šarže vakcíny se prokazuje přímou čelenží a nepřímou metodou prokazující tvorbu neutralizačních protilátek na každém druhu zvířat, pro který je vakcína určena.

Následující požadavky platí pro tekuté přípravky a pro lyofilizované přípravky rekonstituované podle údajů v označení.

Zkouška totožnosti

Vakcína po podání zvířatům podporuje tvorbu specifických neutralizačních protilátek.

Zkouška na čistotu

Bezpečnost. Jestliže je vakcína určena pro více než jeden druh zvířat, včetně psa, provede se zkouška na psech. Jinak se použije jeden z druhů zvířat, pro který je vakcína určena. Dvěma vnímavým zvířatům se vstříkne způsobem uvedeným v označení dvojnásobek nejmenší dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Nevzniknou významné místní nebo systémové reakce.

Inaktivace. Nejméně deseti myším hmotnosti 11 g až 15 g se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml ředění, které odpovídá nejméně pětinásobku udané nejmenší dávky. Pokud vakcína obsahuje protimikrobní konzervační látku nebo adjuvans, rozředí se před aplikací nejvýše desetkrát. V tomto případě, a nebo když vakcinační kmen je patogenní jen pro sající myšky, provede se zkouška na jednodenních až čtyřdenních myškách. Zvířata se pozorují 21 dní. Jestliže více než dvě zvířata uhynou v průběhu prvních 48 h, zkouška se opakuje. Zvířata nemají od 3. do 21. dne po podání žádné příznaky vztekliny nebo jiné anomálie, které by bylo možno přičítat vakcíně.

Místo této zkoušky je možno použít u tkáňových vakcín, které neobsahují žádné adjuvans, vhodnější pomnožovací zkoušky na přítomnost zbytkového infekčního viru, pro kterou se použije stejný druh tkáňových kultur, jaký byl použit pro výrobu vakcíny.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší před klinickými účinky dále definované dávky vzteklinového viru intracerebrálně podaného v porovnáním s množstvím referenčního přípravku inaktivované vakcíny proti vzteklině pro veterinární použití BRP kalibrované v mezinárodních jednotkách nezbytným k dosažení stejné ochrany.

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se používají zdravé myši ve stáří asi 4 týdnů a hmotnosti 11 g až 15 g z jednoho chovu. Myši se rozdělí do nejméně deseti skupin po nejméně deseti zvířatech. Všechny myši jsou stejného pohlaví.

Příprava suspenze k čelenži. Jedné skupině myší se intracerebrálně vstříkne kmen CVS viru vztekliny. Při vzniku příznaků vztekliny ještě před jejich uhynutím se myši usmrtí, odeberou se mozky a z mozkové tkáně se připraví ve vhodném rozpouštědle homogenní suspenze. Po oddělení hrubých částic odstředěním se supernatant použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se rozmrazí a ve vhodném rozpouštědle se připraví sériové ředění. Každé ředění se použije pro jednu skupinu deseti myší. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují 14 dní a v každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se mezi 5. až 14. dnem vyvinuly příznaky vztekliny. Potom se vypočte ID50 neředěné suspenze.

Postup zkoušky. Připraví se nejméně tři sériová ředění zkoušeného přípravku a tři podobné řady ředění porovnávacího přípravku.

Ředění se vyberou tak, aby ředění s nejvyšší koncentrací vakcíny chránilo nejméně 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a ředění s nejnižší koncentrací vakcíny chránilo méně než 50 % zvířat, jimž bylo podáno. Každé ředění se použije u jedné skupiny myší. Každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml příslušného ředění. Za 14 dní po podání vakcíny se připraví suspenze čelenžního viru tak, aby na podkladě předtitrace obsahovala každá čelenžní dávka 50 ID 50 v 0,03 ml. Všem vakcinovaným myším se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml čelenžní suspenze. Mimo to se připraví tři další sériová ředění použitého čelenžního viru. Ředění použité k čelenži a připravená tři další ředění se intracerebrálně vstříknou v dávce 0,03 ml na myš dalším čtyřem skupinám po deseti nevakcinovaných myších. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní. V každé skupině mohou do 4 dní po čelenži uhynout nejvýše dvě myši. V každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se v době od 5 do 14 dní po čelenži vyskytly příznaky vztekliny.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže:

- 50% ochranná dávka zkoušeného i referenčního přípravku je mezi největší a nejmenší dávkou vakcíny podanou myším,

- kontrolní titrace čelenžní suspenze prokáže, že v dávce 0,03 ml bylo dosaženo nejméně 10 ID 50 ,

- interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti,

- statistická analýza ukazuje signifikantní vzestup a žádné signifikantní odchylky od linearity a rovnoběžnosti přímek závislosti odpovědi na dávce.

Vakcína vyhovuje zkoušce, když stanovená účinnost je nejméně 1 m.j. v nejmenší předepsané dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- druh tkáně nebo buněčné kultury, které byly použity pro přípravu vakcíny, a druh původu,

- nejmenší počet mezinárodních jednotek v dávce.

Vaccinum rabiei perorale vivum ad vulpem ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti vzteklině perorální pro lišky

Je to přípravek z imunogenního kmene oslabeného viru vztekliny. Vakcína se vloží do návnady tak, že se mohou asepticky provést dále popsané zkoušky.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Oslabený kmen viru se pomnožuje ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4); v případě, že buněčné kultury jsou savčího původu, jsou prokazatelně prosté viru vztekliny. Virová suspenze se sklízí jedenkrát nebo vícekrát během 14 dnů po naočkování. Vícenásobné sklizně z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň. Virová suspenze se může smíchat s vhodným stabilizátorem. Vakcína může být tekutá nebo lyofilizovaná. Lyofilizovaná vakcína se před použitím rekonstituuje.

Výběr vakcinačního kmene

Pro výrobu vakcíny se může použít jen takový kmen viru, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska imunogenity (viz Stanovení účinnosti) a následujících charakteristik:

- při perorálním podání v doporučené dávce a doporučenou metodou nevzniknou u čtyřiceti lišek v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

- při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti lišek v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

- při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti psů v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

- při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti koček v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,

- v přirozených a experimentálních podmínkách nedojde u divoce žijících hlodavců k rozšíření virového kmene z jednoho zvířete na druhé,

- virový kmen má jeden nebo více stabilních genetických markerů, kterými může být rozlišen od jiných virových kmenů vztekliny.

Zkoušení šarže

Pokud byla zkouška účinnosti provedena s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může se tato zkouška vypustit při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula.

Zkoušky totožnosti

A. Po smíchání s monospecifíckým vzteklinovým antisérem vakcína již není schopna infikovat vnímavé buněčné kultury, do nichž je naočkována.

B. Provede se zkouška na prokázání genetických markerů.

Zkoušky na čistotu

Cizí viry.

a) Po smíchání se specifickým neutralizačním vzteklinovým antisérem nevyvolá vakcína po vyočkování na vnímavou buněčnou kulturu cytopatický efekt. Neprokážou se známky hemaglutinačních nebo hemadsorpčních agens.

b) Vnímavá buněčná kultura se naočkuje ředěními vakcíny 1 : 10 a 1 : 1000 a inkubuje se při 37 °C. Po 2,4 a 6 dnech se buňky obarví různými typy monoklonálních protilátek, které nereagují s vakcinačním kmenem, ale reagují s jinými kmeny viru vztekliny (např. uliční virus, Pasteurův kmen). Vakcína nevykazuje známky znečištění jinými vzteklinovými viry.

Bakterie a houby. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Vakcína se titruje ve vhodných buněčných kulturách. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně množství viru odpovídající nejmenšímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použije se nejméně třicet pět lišek nejméně 3 měsíce starých prostých protilátek neutralizujících vzteklinu. Každému z nejméně dvaceti pěti zvířat se podá perorálně návnada uvedená v označení s vakcínou v množství odpovídajícím minimálnímu titru uvedenému v označení. Nejméně deset zvířat zůstává jako kontrolní. Všechna zvířata se pozorují po dobu 180 dnů. Žádné ze zvířat nevykazuje známky onemocnění vzteklinou. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že pozorovací dobu přežije nejméně dvacet pět vakcinovaných zvířat. Po 180 dnech po vakcinaci se všechny lišky intramuskulárně čelenžují virulentním kmenem viru vztekliny schváleným oprávněnou autoritou. Zvířata se pozorují 90 dnů po infekci. Zvířata, jež uhynula z důvodů, které nelze přisoudit vzteklině, se vyloučí. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že se počet vakcinovaných zvířat ve zkoušce nesníží na méně než dvacet pět. Vakcína vyhovuje zkoušce, když nejvýše dvě z dvaceti pěti vakcinovaných zvířat (nebo statisticky odpovídající počet, když více než dvacet pět vakcinovaných zvířat bylo čelenžováno) vykazují příznaky onemocnění vzteklinou. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejméně devět kontrolních zvířat (nebo statisticky odpovídající počet, pokud více než deset kontrolních zvířat bylo čelenžováno) vykazuje příznaky vztekliny a v mozku těchto zvířat se metodou fluorescenčních protilátek nebo jinou spolehlivou metodou prokáže přítomnost viru vztekliny.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede podstata genetického markeru virového kmene.

Vaccinum rhinotracheitidis infectivae bovinae vivum cryodesiccatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti infekční bovinní rinotracheitidě lyofilizovaná

Je to přípravek z jednoho nebo více oslabených kmenů viru infekční bovinní rinotracheitidy (bovinní herpesvirus 1).

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře (5.2.4). Virová suspenze se shromáždí a smíchá s vhodným stabilizačním roztokem. Tato směs se potom lyofilizuje.

Výběr vakcinačního kmene

Pro výrobu vakcíny se může použít jen takový kmen viru, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska následujících charakteristik: bezpečnost (včetně toho, že nevyvolává potraty a neprochází placentou), nevratnost virulence a imunogenita. Kmen může mít markery. K prokázání bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Pěti telatům ve stáří 3 měsíců nebo v nejnižším věku doporučeném pro vakcinaci, pokud je tento věk méně než 3 měsíce, která nemají protilátky proti infekční bovinní rinotracheitidě, se určeným způsobem podá množství viru odpovídající deseti dávkám vakcíny. Telata se pozorují 21 dní. Telata zůstávají zcela zdravá a neobjeví se významné místní nebo systémové reakce.

Schopnost vyvolat potrat a průchod placentou. Pro zkoušku se použije dvacet čtyři březích krav prostých protilátek proti infekční bovinní rinotracheitidě. Z toho je osm krav ve čtvrtém měsíci březosti, osm krav v pátém měsíci březosti, osm krav v šestém či sedmém měsíci březosti. Každé krávě se zamýšleným způsobem podá množství viru odpovídající deseti dávkám vakcíny. Krávy se pozorují až do konce březosti. Jestliže během pozorování dojde k abortu, provede se zkouška na přítomnost viru infekční bovinní rinotracheitidy. V plodu ani v placentě se nezjistí přítomnost viru ani virových antigenů. U narozených telat ještě před napitím kolostra se provede zkouška na protilátky proti infekční bovinní rinotracheitidě; nezjistí se žádné takové protilátky.

Nevratnost virulence. Od pěti telat použitých ve zkoušce na bezpečnost vakcíny se v době, kdy vakcinační virus může být snadno detekován, odeberou vhodné vzorky. Ověří se přítomnost a titr viru ve vzorcích. Vzorky se potom smíchají a podají intranazálně dvěma vnímavým telatům stejného stáří. V pěti dalších po sobě jdoucích pasážích se v každé pasáži provádí průkaz přítomnosti viru. Telata zůstanou zdravá a nezjistí se významné místní nebo systémové reakce.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná pro průkaz imunogenity.

Zkoušení šarže

Pokud se provede stanovení účinnosti s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může se tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypustit, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkoušky totožnosti

A. Vakcína se rekonstituuje podle údajů v označení. Když se smíchá s vhodným množstvím monospecifického antiséra, rekonstituovaná vakcína již není schopna infikovat vnímavé buněčné kultury, do nichž je inokulována.

B. Ověří se markery kmene.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma vnímavým telatům ve stáří tři měsíce nebo v nejnižším věku doporučeném pro vakcinaci, pokud je tento věk méně než tři měsíce, se podá po deseti dávkách rekonstituované vakcíny způsobem uvedeným v označení. Telata se pozorují 21 dní. Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud zvířata zůstávají zcela zdravá a nezjistí se významné místní nebo systémové změny.

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článek Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Cizí viry. Vakcína se neutralizuje monospecifickým antisérem a inokuluje se do vnímavých buněčných kultur. Kultura se udržují 14 dní a za 7 dní se provede pasáž. Buněčné kultury nejeví známky virové kontaminace.

Titr viru. Titr rekonstituované vakcíny se stanoví na vnímavých buněčných kulturách při teplotě podporující replikaci viru. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně množství viru odpovídající minimálnímu titru viru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá telata 2 až 3 měsíce stará a prostá neutralizačních protilátek proti infekční bovinní rinotracheitidě. Pěti telatům se způsobem uvedeným v označení podá množství rekonstituované vakcíny obsahující množství viru, které odpovídá minimálnímu titru viru uvedenému v označení. Dvě telata jsou jako kontrola. Po 21 dnech se podá sedmi telatům intranazálně množství viru infekční bovinní rinotracheitidy, které u vnímavých telat vyvolá vznik typických příznaků onemocnění, jako je teplota, výtok z očí a nosu a ulcerace na nosní sliznici. Zvířata se pozorují 21 dní. Vakcinovaná telata mají jen mírné příznaky, kontrolní mají typické příznaky. Nejméně u čtyř z pěti vakcinovaných telat se v nazální mukóze zjistí maximální titr viru, který je stokrát nižší než průměr maximálního titru viru zjištěný u kontrolních telat. Průměrný počet dní, kdy je virus vylučován, je nejméně o tři dny kratší u telat vakcinovaných než u telat kontrolních.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vaccinum rubellae vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti zarděnkám

Synonymum. Živá očkovací látka proti zarděnkám

Je to lyofilizovaná suspenze schváleného oslabeného kmene zarděnkového viru. Vakcína se ředí podle návodu bezprostředně před použitím. Vznikne čirá tekutina, jež může být zbarvena přítomným indikátorem pH.

Výroba

Výroba je založena na systému jednotné inokulace a buněčné banky. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu přiměřené imunogenity a bezpečnosti pro člověka. Pokud není prokázáno a schváleno jinak, neprochází virus v hotovém přípravku od základní kultury do přípravy vakcíny více pasážemi, než bylo použito u vakcíny, jejíž bezpečnost a účinnost byla prokázána v klinické studii.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že výrobek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3).

Výchozí kultura viru

Kmen použitého zarděnkového viru má průkaznou dokumentaci, která obsahuje informace o jeho původu a následném zacházení. Aby se předešlo nezbytnému použití opic na zkoušku neurovirulence, připraví se výchozí kultura viru ve velkém množství a uchovává se při teplotách pod -20 °C, pokud je lyofilizována, anebo při teplotě pod60 °C, pokud lyofilizována není. Pro pomnožení viru se použije jenom ta výchozí kultura, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Totožnost. Matečné a pracovní inokulum se prokáží jako zarděnkový virus v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.

Koncentrace viru. Koncentrace viru v matečném a pracovním inokulu se stanovuje k zajištění stejnorodosti výroby.

Cizí antigeny (2.6.16). Pracovní výchozí kultura vyhovuje požadavkům na výchozí kulturu viru.

Neurovirulence (2.6.18). Pracovní výchozí kultura vyhovuje zkoušce na neurovirulenci živých virových vakcín. Pro zkoušku jsou vhodné opice Macaca a Cercopithecus.

Pomnožení viru a jeho sklizeň

Všechny pracovní postupy v buněčné bance a se získanými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do růstových médií se může použít schválené zvířecí (nikoliv lidské) sérum, ale konečné médium pro udržování růstu buněk při pomnožování viru neobsahuje žádné zvířecí sérum. Sérum a trypsin, použité při přípravě buněčné suspenze a při přípravě médií, se zkouší na nepřítomnost cizích antigenů. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a vhodné antibiotikum v nejnižší účinné koncentraci. Je však výhodnější mít po dobu výroby substrát bez antibiotik. Nejméně 500 ml výrobní buněčné kultury se odloží jako neinfikovaná buněčná kultura (kontrolní buňky). V průběhu pomnožování viru se kontroluje teplota inkubace a za 28 dní od naočkování nebo dříve se odebírá virus, a to najednou nebo opakovaně. Opakované odběry z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednu sklizeň viru.

K přípravě konečné várky vakcíny se použije jenom ta sklizeň viru, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Totožnost. Sklizeň viru obsahuje viry, které se prokáží jako zarděnkový virus v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.

Koncentrace viru. Koncentrace viru ve sklizni viru se stanoví ke sledování stejnorodosti výroby a k výpočtu ředění pro konečnou vakcínu. Postupuje se tak, jak je uvedeno v odstavci Stanovení účinnosti.

Cizí antigeny (2.6.16).

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z přípravy buněčné kultury, z níž se získává virus, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na nepřítomnost cizích antigenů (2.6.16).

Konečná várka vakcíny

Virové sklizně, které vyhověly výše uvedeným zkouškám, se spojí a vyčeří, aby se odstranily buňky. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se naředí, jak je zapotřebí.

K přípravě konečné šarže se použije jenom ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícímu požadavku.

Bakterie a houby. Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1); na každou živnou půdu se použije 10 ml zkoušené konečné várky vakcíny.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených nádobek a lyofilizuje se, až obsah vlhkosti dosáhne hodnoty příznivé pro stabilitu vakcíny. Nádobky se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a přístupu vlhkosti.

K použití se propustí jenom ta šarže, která vyhovuje požadavku na tepelnou stabilitu a požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Jestliže u konečné várky vakcíny byla s vyhovujícím výsledkem provedena zkouška na hovězí sérový albumin, může být tato zkouška u šarže vypuštěna.

Tepelná stabilita. Provede se zrychlená rozkladná zkouška zahřátím lyofilizované vakcíny na 37 °C po 7 dní. Koncentrace viru po této době neklesne od výchozí hodnoty o více než 1 log 10 a v každém případě musí být nejméně 10 3 TKD 50 v jedné dávce.

Zkouška totožnosti

Zkoušený přípravek rozpuštěný předepsaným způsobem a smíchaný se specifickým protizarděnkovým sérem není již schopen infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rozpuštěný zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Hovězí sérový albumin. Nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce, stanoveno vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virové částice se stanoví nejméně trojmo, při čemž se použije nejméně pět buněčných kultur pro každé 0,5 log 10 sériové ředění nebo jinou metodu se stejnou přesností. K ověření každé zkoušky se použije vhodný virový porovnávací přípravek. Stanovená koncentrace viru je rovna nejméně koncentraci uvedené v označení; minimální koncentrace uvedená v označení je nejméně 10 3 CCID 5 0 v jedné lidské dávce. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) logaritmu koncentrace viru je menší než ±0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- kmen viru použitý k přípravě vakcíny,

- typ a původ buněk použitých k přípravě vakcíny,

- minimální koncentrace viru,

- varování před stykem s dezinfekčními prostředky,

- doba, v níž se vakcína po rozpuštění musí použít,

- že vakcína se nesmí podat těhotným ženám a že žena nesmí 2 měsíce po očkování otěhotnět.

Vaccinum tetani adsorbatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Adsorbovaná vakcína proti tetanu

Synonymum. Adsorbovaná očkovací látka proti tetanu

Je to tetanický toxoid adsorbovaný na minerální nosič. Toxoid se připravuje formaldehydovou inaktivací toxinu vytvořeného při růstu kultury mikroba Clostridium tetani.

Výroba

Várka přečištěného toxoidu

Výchozí pracovní kultury, které vytvářejí tetanický toxin pro výrobu toxoidu, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuje novým cíleným výběrem. Vysoce toxinogenní kmen Clostridium tetani známého původu a udržování se pěstuje ve vhodné tekuté živné půdě. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Asepticky se shromáždí živné půdy obsahující toxin. Kontroluje se obsah toxinu (Lf v ml), aby bylo možno sledovat pravidelnost výroby. Jednotlivé sklizně se mohou spojit, aby se připravila várka přečištěného toxoidu. Toxin se čistí, aby se odstranily složky, které by mohly u člověka způsobit nežádoucí reakce. Vyčištěný toxin se detoxikuje formaldehydem takovou metodou, která zabrání poškození imunogenní účinnosti toxoidu a jeho zpětné přeměně na toxin, zvláště působením tepla. Přečištění lze také provést až po detoxikaci.

K přípravě konečné várky vakcíny se může použít pouze várka přečištěného toxoidu, který vyhovuje následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost tetanického toxinu. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně nejméně 500 Lf přečištěného toxoidu v 1 ml. Jestliže se u některého ze zvířat během 21 dnů následujících po injekci projeví příznaky tetanu nebo na něj zvíře uhyne, toxoid nevyhovuje zkoušce. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, toxoid nevyhovuje.

Stálost toxoidu. Za použití stejného tlumivého roztoku jako pro konečnou vakcínu, ale bez sorbentu se připraví takové ředění přečištěného toxoidu, aby odpovídalo koncentraci v konečné vakcíně. Naředěný toxoid se rozdělí na dvě stejné části, které se uchovávají po dobu šesti týdnů; jedna část při (5 ±3) °Ca druhá při 37 °C. Pak se oba vzorky podrobí vhodné citlivé zkoušce na přítomnost aktivního tetanického toxinu, jako je podání myším nebo morčatům.

Toxoid vyhovuje zkoušce, jestliže ani jeden ze vzorků nevyvolá žádné známky toxické reakce odpovídající tetanickému toxinu.

Antigenní čistota. Nejméně 1000 Lf na 1 mg bílkovinného dusíku.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví adsorpcí vhodného množství přečištěného tetanického toxoidu na hydratovaný fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý; vzniklá směs je přibližně izotonická s krví. Je možné přidat vhodné protimikrobní konzervační látky. Některé z nich, zvláště fenolového typu, působí nepříznivě na antigenní aktivitu, a nelze je tedy použít.

K přípravě šarže se může použít pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provede se zkouška popsaná ve stati Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Zkouška totožnosti

Zkoušky na čistotu

Specifická neškodnost. Pěti zdravým morčatům o hmotnosti 250 g až 350 g, kterým před tím nebyla podána žádná látka, která by mohla narušit zkoušku, se vstříkne podkožně pětinásobek lidské dávky uvedené v označení. Jestliže během 21 dnů po injekci kterékoli ze zvířat uhyne za příznaků tetanu nebo se u něj jeho příznaky projeví, přípravek nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno zvíře, zkouška se opakuje. Jestliže při opakované zkoušce uhyne více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje.

Hliník. Pokud se jako nosič použije hydratovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Vápník. Pokud se jako nosič použije fosforečnan vápenatý, přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Přípravek vyhovuje zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Provede se jedno z předepsaných stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti tetanu (2.7.8).

Pokud není uvedeno jinak, oprávněná autorita upřednostňuje pro vyhodnocení zkoušky letální metodu.

Dolní mez spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 40 m.j. v jedné lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- minimální množství mezinárodních jednotek v jedné lidské dávce,

- název a množství nosiče,

- že se přípravek před použitím roztřepe,

- že přípravek nesmí zmrznout.

Vaccinum tetani ad usum veterinarium ⟪MEDIA:img_001⟫

Vakcína proti tetanu pro veterinární použití

Připravuje se z tekuté kultury vhodného kmene mikroba Clostridium tetani. Filtrát kultury se inaktivuje takovým způsobem, aby se odstranila toxicita, ale imunogenita zůstala zachována.

Takto vytvořený toxoid se může koncentrovat a čistit a může se přidat vhodné adjuvans.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Při vývoji vakcíny se prokáže její bezpečnost pro každý zvířecí druh, jemuž je určena.

Zkoušky totožnosti

Provede se zkouška totožnosti A, nebo pokud to povaha adjuvans dovoluje, zkouška B.

A. Zkoušený přípravek se podá zdravým vnímavým zvířatům a prokáže schopnost vyvolat tvorbu protilátek proti neurotoxinu Cl. tetani nebo schopnost ochránit před paralytickým účinkem tohoto toxinu.

B. Zkoušený přípravek se upraví tak, že se toxoid oddělí od adjuvancia. Pro látky adsorbované na hydroxid hlinitý je vhodná následující úprava: v přípravku se rozpustí tolik citronanu sodného R, aby výsledná koncentrace byla 100 g/l. Nechá se 16 h stát při 37 °C a odstřeďuje se, dokud se nezíská čirý supernatant. Roztok obsahující toxoid reaguje s vhodným tetanickým antitoxinem za vzniku precipitátu.

Zkoušky na čistotu

Toxicita. Pěti zdravým morčatům hmotnosti 350 g až 450 g, která v minulosti nebyla léčena žádnou látkou, která by mohla ovlivnit tuto zkoušku, se podkožně vstříkne na dvě místa po 5 ml zkoušeného přípravku rozdělených na dvě stejné dávky. Zvířata nemají významné místní ani celkové reakce. Projeví-li se u zvířat během 21 dní po očkování příznaky onemocnění nebo pokud uhynou na tetanus, přípravek nevyhovuje. Pokud z nespecifických příčin uhyne více než jedno morče, zkouška se opakuje. Jestliže některé ze zvířat uhyne i při opakované zkoušce, přípravek nevyhovuje.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví metodou A nebo metodou B.

Metoda A

Použije se deset morčat vážících nejméně 250 g. Každému se podkožně vstříkne takové množství zkoušeného přípravku, které nepřesahuje nejnižší dávku uvedenou v označení jako první dávka. Za 28 dní se provede přeočkování dávkou, která nepřesahuje nejnižší dávku uvedenou jako druhá dávka. Za 14 dní po přeočkování se morčatům odebere krev a vytvoří se směsný vzorek sér.

Účinnost směsného vzorku séra je nejméně 7,5 m.j. tetanického antitoxinu v mililitru kromě zkoušeného přípravku určeného pro lichokopytníky, u něhož je účinnost směsného vzorku séra nejméně 30 m.j. v mililitru.

Pokud je tetanická vakcína pro veterinární použití součástí smíšené vakcíny, není určena pro lichokopytníky, a zkouší-li se ostatní složky vakcíny běžně na králících, může se zkouška účinnosti provést i u tetanické složky na králících. Použije se deset králíků 3 až 6 měsíců starých. Účinnost směsného vzorku séra je potom nejméně 2,5 m.j. v mililitru.

Mezinárodní jednotkou je specifická účinnost neutralizující tetanický toxin obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Účinnost směsného vzorku sér morčat (nebo králíků) se stanoví porovnáním dávky nezbytné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat proti toxickému účinku neměnné zkušební dávky tetanického toxinu s dávkou referenčního přípravku tetanického antitoxinu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách nezbytnou k vytvoření shodné ochrany. K tomuto porovnání je zapotřebí vhodný tetanický toxin, který se použije jako zkušební toxin. Dávka zkušebního toxinu se stanoví proti referenčnímu přípravku, účinnost zkoušeného séra se stanoví proti referenčnímu přípravku za použití zkušebního toxinu. Pokud není uvedeno jinak, oprávněná autorita upřednostňuje pro vyhodnocení zkoušky letální metodu. Pro tuto metodu je shodný počet pokusných zvířat i postup zkoušky s paralytickou metodou. Limitním konečným bodem je však místo paralýzy úhyn zvířete a místo Lp/10 a 50% paralytické dávky se používá dávka L+/10 a LD 50 .

Příprava zkušebního toxinu. Ze sterilního filtrátu osmidenní až desetidenní kultury Cl. tetani v tekuté živné půdě se připraví zkušební toxin. Může se připravit přidáním tohoto filtrátu do glycerolu v poměru jednoho objemového dílu filtrátu k jednomu až dvěma objemovým dílům glycerolu. Roztok zkušebního toxinu se může uchovávat při teplotě 0 °C nebo slabě nižší. Toxin se může též vhodným způsobem lyofilizovat.

Zkušební toxin se vybírá po stanovení dávky Lp/10 pro myši a 50% paralytické dávky. Vhodný toxin obsahuje nejméně l000násobek 50% paralytické dávky v jedné dávce Lp/10.

Dávka Lp/10 (Limes paralyticum). Je to nejnižší množství toxinu, které smícháno s 0,1 m.j. antitoxinu a podkožně vstříknuto myším (nebo morčatům) způsobí 4. den po podání nebo dříve tetanickou paralýzu zvířat.

50% paralytická dávka. Je to množství toxinu, které po subkutánním podání myším (nebo morčatům) způsobí 4. den po podání nebo dříve tetanickou paralýzu poloviny zvířat.

Stanovení zkušební dávky toxinu. Referenční přípravek se rozpustí nebo zředí ve vhodné tekutině tak, aby v 1 ml obsahoval 0,5 m.j. Množství toxinu se změří nebo odváží a zředí se vhodnou tekutinou. Směsi roztoku referenčního přípravku a roztoku zkušebního toxinu se připraví tak, aby každá směs obsahovala v podávaném objemu 0,1 m.j. antitoxinu a jeden ze řady stoupajících objemů zkušebního toxinu (objemy zkušebního toxinu se mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje očekávaný limitní bod). Každá směs se doplní vhodnou tekutinou na stejný konečný objem (0,4 ml až 0,6 ml pro myši nebo 4,0 ml pro morčata). Směsi se 60 min nechají stát ve tmě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši, jimž se zvolená dávka vstříkne podkožně. Zvířata se pozorují 96 h a denně se zaznamenává u každé skupiny zvířat stupeň rozvoje tetanických příznaků. Zkouška se nejméně jedenkrát opakuje a vypočte se zkušební dávka jako průměr jednotlivých zkoušek. Zkušební dávka je množství toxinu obsažené v té směsi, která způsobí tetanickou paralýzu poloviny celkového počtu zvířat, jimž se toxin podal.

Po stanovení zkušební dávky toxinu se může připravit jeho koncentrovaný roztok ve směsi jednoho objemového dílu roztoku chloridu sodného R (9 g/l) a jednoho až dvou objemových dílů glycerolu R. Tento koncentrovaný roztok se může skladovat zmrazený a před použitím se zředí. Specifická aktivita takového roztoku se v častých intervalech stanoví znovu.

Stanovení účinnosti zkoušeného séra.

Předběžná zkouška: Odměří se nebo odváží určité množství zkušebního toxinu a zředí se vhodnou tekutinou tak, aby roztok obsahoval 5 zkušebních dávek v mililitru (roztok zkušebního toxinu). Směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného séra se připraví tak, aby každá směs obsahovala v objemu zvoleném pro injekci zkušební dávku toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra. Každá směs se doplní vhodnou tekutinou na stejný konečný objem. Směsi se 60 min nechají stát chráněny před světlem. Pro každou směs se použijí nejméně dvě zvířata; každému se vstříkne podkožně zvolené množství směsi. Zvířata se pozorují 96 h a denně se zaznamenává u každé skupiny stupeň rozvoje tetanických příznaků. Podle výsledků se zvolí vhodné směsi pro konečnou zkoušku.

Konečná zkouška: Směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného séra se připraví tak, aby každá směs obsahovala v objemu zvoleném pro injekci zkušební dávku toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného séra vzájemně se lišících nejvýše o 20 %, přičemž řada přesahuje konečný limitní bod stanovený v předběžné zkoušce. Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi obsahující v celkovém objemu zvoleném pro injekci stejné množství zkušebního toxinu a stoupající objemy referenčního přípravku (se střední hodnotou 0,1 m.j.). Každá směs se doplní vhodnou tekutinou na shodný konečný objem. Směsi se 60 min nechají stát chráněny před světlem. Pro každou směs se použijí nejméně dvě zvířata; každému se podkožně vstříkne zvolené množství. Zvířata se pozorují 96 h a denně se zaznamenává u každé skupiny stupeň rozvoje tetanických příznaků. Zkoušená směs, která obsahuje 0,1 m.j. v podaném objemu, je ta směs, která způsobí tetanickou paralýzu shodného nebo téměř shodného počtu zvířat jako referenční směs obsahující 0,1 m.j. v podaném objemu. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných výsledků. Výsledky jsou platné pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) jsou stanoveny takto:

- 85 % až 114 %, použila-li se dvě zvířata na dávku,

- 91,5 % až 109 %, použila-li se tři zvířata na dávku,

- 93 % až 108 %, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Metoda B

Tato metoda se může použít pouze pro určité přípravky. Metoda není především vhodná pro polyvalentní vakcíny nebo pro vakcíny s olejovým adjuvans.

Provede se stanovení účinnosti (adsorbované) vakcíny proti tetanu (2.7.8) jednou z popsaných metod.Stanovená účinnost je nejméně 150 m.j.v nejnižší dávce, která je uvedena v označení na obalu.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

- že přípravek se před použitím roztřepe,

- u přípravků obsahujících adjuvans jeho název.

Vaccinum tuberculosis (BCG) cryodesiccatum ⟪MEDIA:img_001⟫

Vakcína proti tuberkulóze (BCG) lyofilizovaná

Synonymum. Očkovací látka proti tuberkulóze

Je to přípravek obsahující živé bakterie získané z kultury bacila Calmettova a Guérinova (Mycobacterium bovis BCG), jejichž schopnost chránit proti tuberkulóze byla prokázána.

Výroba

Vakcínu připravuje pracovní skupina složená ze zdravých osob, které nepracují s jiným infekčním agens; především nemohou pracovat s virulentními kmeny Mycobacterium tuberculosis, ani nemohou být vystaveni známému riziku nákazy tuberkulózou. Přípravek je citlivý na sluneční světlo: postupy jeho přípravy jsou uspořádány tak, aby všechny kultury a vakcíny byly chráněny před přímým slunečním světlem a ultrafialovým zářením při všech stupních výroby, zkoušení a uchovávání.

Příprava je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní postup prokazatelně zajišťuj e výrobu stejnorodé vakcíny, která u člověka vyvolává odpovídající senzitivitu na tuberkulin, která má přijatelnou protektivní účinnost na zvířatech a je bezpečná. Vakcína se připravuje z kultur, které pocházejí z matečného inokula při co nejmenším možném počtu subkultur a ve všech případech nejvýše osmi subkulturami. Během těchto subkultivací se přípravek lyofilizuje nejvýše jedenkrát.

Bakteriální inokula

Kmen pro matečné iokulum se vybere a udržuje tak, aby se zachovala jeho stabilita, schopnost senzibilizovat člověka a morče na tuberkulin a chránit zvířata proti tuberkulóze a také aby byl relativně nepatogenní pro člověka a laboratorní zvířata. Vlastnosti použitého kmene mají být doloženy historickými záznamy o jeho původu a dalším následným zacházením.

Z primární pracovní kultury se připraví vhodná šarže vakcíny, která se uchovává jako porovnávací vakcína. Je-li připraveno nové pracovní inokulum, provedou se s šarží vakcíny z něho připravené vhodné zkoušky na pozdní přecitlivělost na morčatech; vakcína se prokazatelně signifikantně neliší ve své účinnosti od porovnávací vakcíny.

Pro pomnožení se použije jen to pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům.

Totožnost. Prokáže se, že bakterie v pracovním inokulu jsou Mycobacterium bovis BCG.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml. Pracovní inokulum vyhovuje zkoušce na sterilitu kromě přítomnosti mykobakterií.

Virulentní mykobakterie. Pracovní inokulum se zkouší postupem uvedeným ve zkouškách na čistotu, použije se deset morčat.

Schopnost indukovat odpověď morčat. Schopnost pracovního inokula indukovat přecitlivělost na tuberkulin se prokáže na morčatech.

Pomnožení a sklizeň

Bakterie se kultivují ve vhodné živné půdě nejdéle 21 dní v povrchové nebo hloubkové kultuře. Živná půda neobsahuje složky, o nichž je známo, že u člověka způsobují toxickou nebo alergickou reakci nebo že způsobují přeměnu bakterií na kmen virulentní pro morčata. Kultura se sklidí a suspenduje ve sterilní živné půdě, která chrání životnost vakcíny, což se určí vhodnou metodou stanovení počtu živých zárodků.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné sklizně nebo spojením jednotlivých sklizní. Může se přidat stabilizátor, jestliže stabilizátor vadí při stanovení koncentrace bakterií v konečné várce vakcíny, provede se stanovení ještě před přidáním stabilizátoru.

Pro přípravu šarže vakcíny se použije jen ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Virulentní mykobakterie. Zkouší se postupem uvedeným ve Zkouškách na čistotu.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml. Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu kromě přítomnosti mykobakterií.

Stanovení počtu živých zárodků. Stanovení počtu živých zárodků v mililitru se provede na pevné živné půdě vhodnou metodou pro zkoušenou vakcínu nebo se provede stanovení adenosintrifosfatu bioluminiscenční reakcí. Provede se současně s referenčním přípravkem stejného kmene. Koncentrace bakterií. Celková koncentrace bakterií se stanoví vhodnou metodou buď přímo stanovením bakteriální hmoty, nebo nepřímo zákalovou metodou kalibrovanou podle množství mikroorganismů. Je-li bakteriální koncentrace stanovena před přidáním stabilizátoru, stanoví se koncentrace v konečné várce vakcíny přepočtem. Celková koncentrace bakterií je v rozmezí schváleném pro jednotlivé přípravky.

Poměr počtu živých zárodků k celkové koncentraci bakterií není nižší než poměr schválený pro jednotlivé přípravky.

Šarže

Konečná várka vakcíny se rozplní do sterilních obalů a lyofilizuje se tak, aby zbytková vlhkost byla vhodná pro stabilitu vakcíny; obaly se uzavřou buď ve vakuu, nebo v plynu, který vakcíně neškodí.

Doba použitelnosti může být nejvýše 4 roky od data sklizně kromě případu, kdy se naplněné a uzavřené obaly skladují při teplotě -20 °C nebo nižší.

Pouze šarže, která vyhovuje dále uvedeným požadavkům na počet živých zárodků a jednotlivým požadavkům uvedeným v odstavcích Zkoušky totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení počtu zárodků, může být uvolněna k použití. Jestliže zkouška na přítomnost virulentních mykobakterií byla provedena s vyhovujícím výsledkem u konečné várky vakcíny, je možno ji vynechat u šarže. Je-li provedena zkouška na zvýšenou kožní dráždivost s vyhovujícím výsledkem u pracovního inokula a u pěti po sobě následujících šarží z něho připravených, lze tuto zkoušku u šarže vynechat.

Počet živých zárodků. Počet živých zárodků v mililitru rekonstituované vakcíny se stanoví na pevné živné půdě metodou, která je vhodná pro zkoušenou vakcínu, nebo se provede stanovení adenosintrifosfatu bioluminiscenční reakcí. Poměr počtu živých zárodků před a po lyofilizaci není nižší než hodnota určená pro daný přípravek.

Zkoušky totožnosti

Totožnost zkoušeného přípravku se prokáže mikroskopickým vyšetřením přítomnosti acidorezistentních bacilů v obarvených nátěrech a při kultivaci na pevných půdách růstem kolonií charakteristického vzhledu.

Zkoušky na čistotu

Virulentní mykobakterie. Každému ze šesti morčat hmotnosti 250 g až 400 g, jimž nebyla podána žádná látka, která by mohla ovlivnit tuto zkoušku, se podkožně nebo nitrosvalově vstříkne množství vakcíny odpovídající nejméně padesáti lidským dávkám. Zvířata se pozorují nejméně 42 dní. Po uplynutí této doby se morčata usmrtí a při pitvě se hledají známky infekce tuberkulózou. Menší reakce v místě aplikace se nehodnotí. Zvířata, která uhynou během sledované doby, se také vyšetřu-jí na tuberkulózu. Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud žádné ze zvířat nevykazuje známky tuberkulózy a pokud během sledované doby neuhyne více než jedno morče. Jestliže během sledované doby uhynou dvě morčata a pitvou se neprokáže tuberkulóza, zkouška se opakuje na dalších šesti morčatech. Vakcína vyhovuje, jestliže během 42 dnů po podání neuhyne více než jedno morče a pitva neprokáže žádné známky tuberkulózy.

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1) kromě přítomnosti mykobakterií.

Nadměrná kožní reaktivita. Použije se šest zdravých bílých nebo světle zbarvených morčat hmotnosti nejméně 250 g, jimž nebyla podána žádná látka, která by mohla tuto zkoušku ovlivnit. Podle randomizačního plánu se každému morčeti intradermálně podá 0,1 ml rekonstituované vakcíny a dalších dvou desetinásobných sériových ředění a stejné dávky porovnávací vakcíny. Léze v místě podání se sledují 4 týdny. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže reakce, které vyvolala, se výrazně neliší od reakcí vyvolaných porovnávací vakcínou.

Teplotní stabilita. Vzorky lyofilizované vakcíny se ponechají 4 týdny při 37 °C. V zahřáté i nezahřáté vakcíně se stanoví počet živých zárodků postupem uvedeným dále. Rozdíl počtu živých zárodků v zahřáté vakcíně oproti nezahřáté je nejvýše 20 %.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení počtu zárodků

Počet živých zárodků v rekonstituované vakcíně se stanoví na pevné živné půdě metodou vhodnou pro zkoušenou vakcínu. Počet je v rozmezí uvedeném v označení. Současně se stanoví počet živých zárodků v porovnávací vakcíně.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

- nejnižší a nejvyšší počet živých zárodků v mililitru rekonstituované vakcíny,

- že se vakcína chrání před přímým slunečním světlem,

- že se vakcína použije bezprostředně po otevření a zbytek se znehodnotí,

- věková skupina, pro kterou je vakcína určena,

- dávka pro každou věkovou skupinu.

Vaccinum varicellae vivum ⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti planým neštovicím

Je to lyofilizovaný přípravek oslabeného kmene OKA Herpesvirus varicellae. Vakcína se podle údajů v označení rekonstituuje bezprostředně před použitím; vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace a na systému buněčných bank. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stále stejnou živou vakcínu přiměřené imunogenity a bezpečnosti pro člověka. Virus v konečné vakcíně neprošel více než třiceti osmi pasážemi v buněčných kulturách od viru, který byl původně izolován.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3).

Virové inokulum

Kmen viru planých neštovic je určen jako OKA podle původních záznamů, které obsahují informaci o původu viru a následné manipulaci s ním. Virus nikdy nebyl pasážován v kontinuální buněčné linii. Inokulum se připravuje na stejném druhu buněk, jaký se použije při výrobě konečné vakcíny. Aby se předešlo nadměrnému používání opic ve zkoušce na neurovirulenci, připraví se virové inokulum ve velkém množství a uchovává se lyofilizované při teplotách nižších než -20 °C nebo, pokud není lyofilizované, při teplotách nižších než -60 °C.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k pomnožení viru.

Zkouška totožnosti. V matečných i pracovních inokulech se prokáže virus planých neštovic séroneutralizační zkouškou v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Koncentrace viru v matečných i pracovních inokulech se stanoví tak, jak je předepsáno ve zkoušce Stanovení účinnosti, a slouží ke sledování stálosti výroby.

Cizí agens (2.6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům na inokula živých virových vakcín; na zkoušku v buněčných kulturách se odebírá vzorek 50 ml.

Neurovirulence (2.6.18). Pracovní inokulum vyhovuje zkoušce živých virových vakcín na neurovirulenci.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnou bankou a s následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do živných médií se může použít schválené zvířecí (nikoliv lidské) sérum. Sérum a trypsin použité k přípravě buněčných suspenzí a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Při výrobě se dává přednost substrátu bez antibiotik. Jako nenaočkovaná kontrola (kontrolní buňky) se uchovává 5 % buněk použitých k výrobě vakcíny, nejméně však 50 ml. Infikované buňky tvořící jednu sklizeň se promyjí, uvolní se s povrchu podložky a smíchají se. Buněčná suspenze se lyzuje ultrazvukem.

Pouze sklizeň viru, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Zkoušky totožnosti. Sklizeň viru obsahuje virus, který se dokáže jako virus planých neštovic séroneutralizační zkouškou v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Koncentrace infekčního viru ve sklizni viru se stanoví tak, jak je předepsáno v odstavci Stanovení účinnosti, aby se zajistila stálost výroby a aby se stanovilo ředění, jež se má použít pro konečnou várku vakcíny.

Cizí agens (2.6.16). Pro zkoušku na buněčných kulturách se použije 50 ml.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky výrobní buněčné kultury, z níž se odvozuje jednotlivá sklizeň, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Konečná várka vakcíny

Sklizně viru, které vyhovují výše uvedeným zkouškám, se spojí a vyčeří, aby se odstranily buňky. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se zředí vhodným způsobem.

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1); na každou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje z hlediska všech požadavků uvedených v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití. Pokud byla zkouška na bovinní sérumalbumin provedena s uspokojivým výsledkem na konečné várce vakcíny, může být u šarže vypuštěna.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína rekonstituovaná podle údajů v označení smíchá se specifickými protilátkami na Herpesvirus varicellae, není již schopna infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 0,5 ug v lidské dávce: stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virus se titruje na nejméně deseti buněčných kulturách pro každé čtyřnásobné ředění nebo metodou o stejné přesnosti. K validaci každé zkoušky se použije vhodný referenční virový přípravek. Koncentrace viru je nejméně 2,0. 10 3 PFU v lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení se uvede:

- virový kmen použitý k přípravě vakcíny,

- typ a původ buněk použitých k přípravě vakcíny,

- varování před stykem s dezinfekčními prostředky,

- minimální koncentrace viru,

- že se vakcína nepodává těhotným ženám,

- v jaké době po rekonstituci je třeba vakcínu použít.

Vaccinum variolae gallinaceae vivum cryodesiccatum⟪MEDIA:img_001⟫

Živá vakcína proti neštovicím drůbeže lyofilizovaná

Je to přípravek z jednoho nebo více oslabených kmenů holubího pox-viru, slepičího pox-viru nebo krůtího pox-viru.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Každý virus se pomnoží na chorioalantoidních membránách kuřecích embryí z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Jsou-li buněčné kultury ptačího původu, jsou získány z chovů prostých specifikovaných patogenů. Virové suspenze se shromáždí, smíchají s vhodnou stabilizující tekutinou a lyofilizují se.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu vakcíny se může použít pouze virový kmen prokazatelně uspokojivý z hlediska imunogenity a bezpečnosti.

Zkoušení šarže

Pokud se provedou zkouška na viry ptačí leukózy, zkouška na cizí viry na kuřecích embryích a zkouška na adenoviry, reoviry a viry ptačí laryngotracheitidy s uspokojujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, mohou se při rutinních kontrolách jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypustit, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno na reprezentativní šarži vakcíny s uspokojivými výsledky, může se tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených ze stejného inokula vypustit, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Rekonstituovaná vakcína chrání vnímavá kuřata proti neštovicím drůbeže.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů nejnižšího stáří udávaného pro vakcinaci. Každému kuřeti se podá způsobem uvedeným v označení nebo v přibalovém letáku pro tuto kategorii zvířat deset dávek vakcíny rekonstituované tak, aby se získala koncentrace vhodná pro zkoušku. Kuřata se pozorují 21 dní. Jestliže v období pozorování uhynou více než dvě kuřata z příčin, které nelze přisoudit vakcíně, zkouška se opakuje. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže žádné z kuřat neuhyne z příčin, které lze přisoudit vakcíně, nebo nevykazuje jiné než mírné, přechodné místní příznaky.

Cizí viry zkouškou na kuřecích embryích (2.6.3). Co možná nejvíce neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití kuřecích embryí provedené bez provedení pasáží; opomíjejí se abnormality způsobené vakcinačním virem, který nebyl neutralizován.

Cizí antigeny zkouškou na kuřatech (2.6.6). Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí antigeny při použití kuřat.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Co možná nejvíce neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na viry s následujícími modifikacemi; nedělají se subkultury fibroblastů a místo komplement-fixační zkoušky se provádí ELISA s použitím IgG specifického pro skupinově specifický antigen ptačí leukózy.

Adenoviry, reoviry a virus ptačí laryngotracheitidy. Zkoušky na adenoviry, reoviry a virus ptačí laryngotracheitidy jsou provedeny ve zkoušce na cizí antigeny při použití kuřat a jsou negativní.

Mykoplazmata (2.6.7). Vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Bakterie a houby. Provede se kvantitativní zkouška na bakterie a houby. Vakcína obsahuje nejvýše jeden saprofytický mikroorganismus v dávce a je prostá patogenních mikroorganismů. Každá tekutina dodávaná s vakcínou vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Titr viru. Vakcína se titruje v buněčných kulturách nebo inokulací na chorioalantoidní membránu kuřecích embryí 9 až 11 dní starých. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení nebo v přibalovém letáku.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá kuřata z jednoho chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nejnižšího stáří uvedeného v označení. Každému z nejméně dvaceti kuřat pro každý z udávaných způsobů podání se podá takový objem rekonstituované vakcíny, který obsahuje množství viru, jež odpovídá

minimálnímu titru uvedenému v označení nebo v příbalovém letáku. Jako kontrola se použije dvacet kuřat. Po 21 dnech se každé kuře čelenžuje intrafolikulámím podáním nebo skarifikací virulentním kmenem viru neštovic drůbeže. Kuřata se pozorují 21 dní. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže na konci doby pozorování přežívá nejméně 90 % vakcinovaných kuřat a nejeví žádné příznaky onemocnění a všechny kontroly projevují příznaky onemocnění. Opomíjejí se přechodné místní reakce, které se objeví u vakcinovaných kuřat v průběhu 6 dní po čelenži.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede stáří zvířat, ve kterém mají být vakcinována.

6.2.3 Radiofarmaceutické přípravky

Radiofarmaca ⟪MEDIA:img_001⟫

Radiofarmaka

Synonymum. Radiopharmaceutica

Ustanovení tohoto článku se vztahují na lékopisné články zabývající se radiofarmaky. Požadavky tohoto článku se nevztahují nutně na radiofarmaka, která lékopis neobsahuje.

Radiofarmaka jsou přípravky obsahující jeden nebo více radionuklidů.

Nuklid je druh atomu charakterizovaný počtem protonů a neutronů v jádře (tudíž jeho atomovým a hmotnostním číslem) a energetickým stavem jádra. Izotopy daného prvku jsou nuklidy se stejným atomovým číslem, ale s rozdílným číslem hmotnostním. Radionuklidy (radioaktivní nuklidy) se samovolně přeměňují na jiné nuklidy. Přeměna může být provázena emisí nabitých částic, elektronovým záchytem (EZ) nebo izomerním přechodem (IP). Nabité částice emitované z jádra mohou být částice alfa (jádra helia s hmotnostním číslem 4) nebo částice beta (elektrony se záporným nebo kladným nábojem, β- nebo β+, β+ jsou známy jako pozitrony). Emise nabitých částic z jádra může být provázena zářením gama; toto záření je také emitováno při procesu izomerního přechodu. Emise záření gama může mít za následek vyražení elektronu z obalu atomu, prázdné místo se doplní elektronem z vyšší slupky, a to je doprovázeno emisí fotonu gama a následnou emisí rtg-paprsků. Tento jev je znám jako vnitřní konverze. Tato sekundární emise může být částečně nahrazena vyražením elektronů, známých jako Augerovy elektrony. Při kontaktu s hmotou dochází k anihilaci β+ částic, která je doprovázena emisí záření gama o energii 511 keV.

Přeměna radionuklidů probíhá exponenciálně. Čas, za který se přemění polovina počáteční hodnoty radioaktivity, se nazývá poločas přeměny (T ½ ) a je charakteristický pro každý radionuklid.

Pronikavost každého záření se liší podle jeho druhu a energie. Částice alfa jsou zcela absorbovány vrstvou tuhých nebo kapalných látek o tloušťce od několika mikrometrů do několika desítek mikrometrů. Částice beta jsou zcela absorbovány vrstvou o tloušťce od několika milimetrů do několika centimetrů. Záření gama není úplně absorbováno, pouze zeslabeno a tloušťka vrstvy potřebná k desetinásobnému zeslabení může být např. až několik centimetrů olova. Čím je hustota absorbátoru vyšší, tím kratší je dosah částic alfa a beta a tím větší je zeslabení záření gama.

Každý radionuklid je charakterizován stálým poločasem přeměny, vyjádřeným v jednotkách času, a druhem a energií emitovaného záření. Energie je udávána v elektronvoltech (eV), kiloelektronvoltech (keV) nebo v megaelektronvoltech (MeV). Radioaktivita (aktivita) přípravku je počet jaderných přeměn za jednotku času.

Aktivita radionuklidu (množství radioaktivity) byla dříve vyjadřována v jednotkách curie (Ci), což je 3,7 . 10 10 přeměn za sekundu, dále milicurie, mikrocurie nebo nanocurie.

V mezinárodní soustavě jednotek (SI) se množství radioaktivity vyjadřuje v becquerelech (Bq), což je 1 jaderná přeměna za sekundu. Následné faktory umožňují převod mezi těmito dvěma systémy jednotek:

⟪TABLE:tbl_001⟫

Absolutní měření aktivity radionuklidu v daném vzorku může být provedeno úplně a přesně pouze tehdy, jsou-li známy druh a energie emitovaných záření a známe-li jejich relativní zastoupení. Toto měření vyžaduje specializovanou laboratoř. Identifikace a měření záření mohou být provedeny porovnávací a poměrovou metodou za použití referenčních přípravků (etalonů) poskytovaných národní laboratoří.

Základní pojmy

Radioaktivní zdroj (zářič). Radioaktivní materiál poskytující ionizující záření.

Uzavřený zářič. Radioaktivní zářič, při jehož použití radioaktivní materiál nepřijde do přímého styku s okolním prostředím. Skládá se z radioaktivního materiálu pevně zabudovaného v neaktivních tuhých látkách nebo je uzavřen do obalu z vhodného odolného materiálu, který zabraňuje pronikání radioaktivní látky a jakékoli možnosti kontaminace při obvyklém používání.

Otevřený zářič. Radioaktivní zářič, při jehož použití radioaktivní materiál přijde do přímého kontaktu s okolním prostředím. U otevřeného zářiče je radioaktivní materiál přímo přístupný. Předpokládá se, že tento materiál bude vystaven fyzikální nebo chemické manipulaci, během níž se může přenášet z jednoho obalu do druhého. Radiofarmaka patří k tomuto druhu zářičů.

Radionuklidová čistota. Poměr aktivity daného radionuklidu a celkové aktivity zářiče vyjádřený v procentech. K vyjádření tohoto poměru může být také používán termín "radioaktivní čistota" nebo "radioizotopová čistota".

Radiochemická čistota. Poměr aktivity daného radionuklidu přítomného v zářiči v určité chemické formě a celkové aktivity tohoto radionuklidu, vyjádřený v procentech.

Chemická čistota. Poměr hmotnosti látky přítomné v určité chemické formě a celkové hmotnosti látek obsažených v zářiči po vyloučení pomocných látek nebo rozpouštědel, vyjádřený v procentech.

Nosič. Stabilní izotop daného radionuklidu, který se přidává k radioaktivnímu přípravku ve stejné chemické formě, v jaké je přítomen radionuklid.

Měrná radioaktivita (měrná aktivita). Aktivita radionuklidu vztažená na jednotku hmotnosti daného prvku nebo jeho chemické formy. Například měrná aktivita fosforečnanu[ 32 P] sodného je vyjádřena následovně: 11,1 MBq fosforu-32 v miligramu fosforečnanového iontu, vztaženo k určenému datu a hodině.

Objemová aktivita (koncentrace radioaktivity). Aktivita radionuklidu vztažená na jednotku objemu roztoku, ve kterém je přítomen.

Zkoušky totožnosti

Radionuklid je určen svým poločasem přeměny nebo druhem a energií záření nebo oběma způsoby, jak je popsáno v článku.

Měření poločasu přeměny. Poločas přeměny se měří vhodným detekčním přístrojem, jako je ionizační komora, Geiger-Müllerův počítač nebo scintilační detektor. Radiofarmaka se měří jako taková, nebo po vhodném zředění rozpuštěné tobolky. Zvolená hodnota aktivity, se zřetelem na experimentální podmínky, musí být dostatečně vysoká, aby umožnila detekci během několika předpokládaných poločasů přeměny, ale neměla by být tak vysoká, aby se projevil jev "ztráty impulzů" v důsledku mrtvé doby Geiger-Müllerova počítače nebo náhodných koincidencí u scintilačního detektoru.

Radioaktivní zářič se připraví tak, aby se vyloučila ztráta materiálu během manipulace. Kapalina (roztok) se plní do ampulí nebo uzavřených zkumavek. Tuhá látka (případně zbytek po sušení v tobolce) se přikryje plátkem z přilnavého acetatu celulosy nebo z jiného materiálu, jehož hmotnost na jednotku plochy je dostatečně malá, aby významně neoslabovala sledované záření.

Stejný zářič se měří za shodných geometrických podmínek v intervalech, obvykle odpovídajících polovině poločasu přeměny, celkově po dobu rovnou asi třem poločasům přeměny. Správná funkce přístroje se kontroluje za použití zářiče s dlouhým poločasem přeměny, a je-li to třeba, provede se korekce odchylek (viz Stanovení radioaktivity).

Do grafu se vynese časová závislost logaritmu počtu impulzů za jednotku času (četnosti) nebo časová závislost elektrického proudu, podle typu použitého přístroje. Vypočtený poločas přeměny by se neměl lišit o více než 5 % od poločasu přeměny udaného v lékopise.

Křivka exponenciální přeměny (rozpadová křivka) je popsána rovnicí

At=A0e-λt ,

v níž značí:

At - aktivitu v čase t,

A 0 - aktivitu v čase t = 0,

λ - přeměnovou konstantu charakteristickou pro každý radionuklid,

e - základ přirozených logaritmů.

Poločas přeměny (T ½ ) souvisí s přeměnovou konstantou A podle vztahu:

T1/2=0,693λ.

Aktivita přípravku se měří v určitém čase. Aktivita v jiném čase se může vypočítat z exponenciální rovnice, stanovit z tabulek nebo se může určit z grafu vyneseného pro každý radionuklid.

Stanovení druhu a energie záření. Druh a energie emitovaného záření mohou být stanoveny několika způsoby, např. použitím spektrometrie nebo sestavením křivky zeslabení. Pro analýzu záření beta se obvykle používá sestavení křivky zeslabení; pro stanovení záření gama se většinou používá spektrometrie.

Křivka zeslabení se vynáší: pro čisté zářiče beta v případě, že není možné použít spektrometr pro záření beta; pro smíšené zářiče beta a gama v případě, že není možné použít spektrometr pro záření gama. Tato metoda odhadu maximální energie záření beta poskytuje pouze přibližnou hodnotu. Předpokladem správného měření je dodržení konstantních geometrických podmínek. Zářič se umístí před tenké okénko Geiger-Müllerova počítače nebo proporcionálního detektoru. Zářič je chráněn tak, jak je popsáno výše. Při měření četnosti impulzů zářiče je mezi ním a počítačem umísťováno postupně minimálně šest hliníkových fólií (stínítek) s postupně se zvyšující hmotností na jednotku plochy. S nejsilnější fólií se měří konstantní četnost impulzů. U čistých zářičů beta není četnost impulzů ovlivňována přidáním dalších fólií. Fólie se vkládají takovým způsobem, aby byly dodrženy konstantní geometrické podmínky. Vynese se závislost logaritmu četnosti impulzů na hmotnosti na jednotku plochy (mg/cm 2 ) pro každou fólii. Stejným způsobem je graf vynesen pro referenční přípravky. Výsledek je stanoven na základě střední části křivky, která je prakticky lineární.

Hmotnostní součinitel zeslabení (μ m ) závisí na energii záření beta a na fyzikálních a chemických vlastnostech fólie. Vyjadřuje se ve čtverečních centimetrech na miligram (cm2/mg). Vypočítá se z grafu popsaného výše podle vztahu:

μm=2,303m2-m1logA1-logA2 ,

v němž značí:

m 1 - hmotnost na jednotku plochy nejtenčí fólie,

m 2 - hmotnost na jednotku plochy nej silnější fólie,

m 1 a m 2 se nacházejí v lineární části křivky zeslabení,

A 1 - četnost impulzů odpovídající m 1 ,

A 2 - četnost impulzů odpovídající m 2 .

Takto vypočítaný hmotnostní součinitel zeslabení μ m se neliší o více než 10 % od součinitele zeslabení referenčního přípravku stejného radionuklidu, který byl měřen za stejných podmínek.

Gama spektrometrie je založena na schopnosti některých látek (scintilátorů) emitovat světelné záření po dopadu záření gama. Počet vyslaných světelných fotonů je úměrný energii absorbované ve scintilátoru. Světelné záření je pak převedeno na elektrické impulzy s výškou (amplitudou) přibližně úměrnou energii, kterou fotony gama ztratily ve scintilátoru. Vyhodnocení výchozích impulzů vhodným amplitudovým analyzátorem poskytuje scintilační energetické spektrum zářiče. Scintilační spektra záření gama vykazují jeden nebo více charakteristických píků odpovídajících energiím záření gama daného zářiče. Tyto píky jsou doprovázeny dalšími píky různých šířek, které vznikly vlivem sekundárních účinků záření na scintilátor nebo na okolní materiál. Tvar získaného spektra závisí na použitém přístroji a geometrickém uspořádání zdroje a detektoru; přístroj j e nezbytně nutné kalibrovat pomocí referenčního zářiče sledovaného radionuklidu.

Výhodnějším detektorem pro gama spektrometrii je polovodičový lithium-germaniový detektor. Tyto přístroje mohou mít energetické rozlišení (plná šířka píku v polovině maxima výšky) 2,0 keV až 2,5 keV při energii 1,3 MeV, a lze tedy identifikovat píky vzdálené od sebe 5 keV. Naproti tomu scintilační spektrometr s krystalem Nal(T1) má podstatně horší energetické rozlišení (asi 50 keV). Výstup z těchto spektrometrů je představován elektrickými impulzy, jejichž amplituda odpovídá energii zaznamenaného záření gama. Analýza impulzů po jejich zesílení se provádí mnohakanálovým analyzátorem, který zobrazuje spektrum daného zářiče gama. Vztah mezi energií gama a počtem a číslem kanálu může být jednoduše stanoven pomocí zářiče emitujícího záření gama o známé energii.

Detekční systém musí být kalibrován, neboť detekční účinnost je funkcí energie záření gama a závisí na druhu zářiče a na vzdálenosti detektoru od zářiče. Detekční účinnost může být změřena za použití kalibrovaného vzorku sledovaného radionuklidu. Většinou se však používá graf detekční účinnosti v závislosti na energii záření gama, který se sestaví ze série kalibrovaných zářičů různých radionuklidů.

Spektrum záření gama radionuklidu, který emituje pouze záření gama, je charakteristické pro každý radionuklid; je vytvořeno fotony určitých energií emitovaných s daným zastoupením (počtem fotonů na 100 přeměn radionuklidu). Tato vlastnost může být využívána ke kvalitativnímu i kvantitativnímu stanovení radionuklidů obsažených v zářiči a usnadňuje stanovení stupně radionuklidové čistoty detekcí píků jiných radionuklidů, než které jsou očekávány.

Amplituda píků ve scintilačním nebo polovodičovém spektru zářiče klesá s jeho poločasem přeměny. Je-li v zářiči přítomna radioaktivní nečistota s delším poločasem přeměny, lze ji zaznamenat na základě charakteristických píků, jejichž amplituda se snižuje s rozdílným poločasem přeměny, než je poločas přeměny sledovaného radionuklidu. Nečistotu lze identifikovat vyhodnocením poločasu přeměny interferujících píků.

Tabulka (uvedená níže) ukazuje všeobecně uznávané fyzikální charakteristiky radionuklidů používaných přípravků, které jsou uvedeny v lékopise. V tabulce jsou navíc uvedeny i fyzikální charakteristiky hlavních nečistot radionuklidů.

Stanovení radioaktivity

Absolutní měření radioaktivity daného vzorkuje možné jen v případě, že je známo přeměnové schéma nuklidu. Je obvykle založeno na koincidenční metodě, při níž např. záření beta a záření gama jsou zaznamenány odděleně i současně (v koincidenci) speciálními přístroji. Četnosti zaznamenané odděleně a četnosti zaznamenané v koincidenci postačují pro stanovení účinnosti a počtu přeměn radionuklidu za jednotku času (aktivity radionuklidu). V praxi je třeba mnoho korekcí pro dosažení správného výsledku.

Relativní měření aktivity radionuklidu se provádí obvykle porovnáním s referenčním zářičem za použití Geiger-Müllerova počítače, proporcionálního počítače, scintilačního detektoru nebo ionizační komory. Geiger-Müllerův počítač se používá k měření zářičů beta a beta-gama; scintilační a polovodičové detektory se používají k měření záření gama; zářiče beta s nízkou energií vyžaduj í kapalné scintilační detektory.

Při použití kteréhokoli přístroje je nezbytné pracovat za přesně definovaných geometrických podmínek tak, aby radioaktivní zářič byl vždy umístěn v přístroji ve stejné poloze, tj. že jeho vzdálenost od měřicího zařízení je konstantní a zůstává stejná i při měření referenčního přípravku. Roztoky radiofarmak mohou být měřeny např. v ionizačních komorách nebo na scintilačních detektorech se studnovým krystalem. Pro určité typy přístrojů, jako je Geiger-Müllerův počítač s koncovým okénkem nebo scintilační detektor s plošným krystalem, je však vhodnější používat odparku. Doporučuje se suchý odparek přikrýt proužkem přilnavého acetatu celulosy, jehož hmotnost na jednotku plochy by měla být menší než 10 mg/cm 2 , takže absorpce záření je zanedbatelná. Odparek referenčního přípravku by měl být pokud možno shodný s odparkem zkoušeného roztoku, tj. oba roztoky by měly obsahovat stejné substance o stejné koncentraci a odpařování by se mělo provádět za stejných podmínek, na povrchu ze stejného materiálu a na stejné ploše. Při dodržení těchto předpisů jsou dosažené výsledky vyhovující při použití kteréhokoli měřicího přístroje. Je nezbytné, aby účinnost měřicího přístroje byla konstantní během doby měření; kontroluj e se měřením sekundárního zářiče obsahujícího radionuklid s dlouhým poločasem přeměny.

Nízkoenergetické zářiče beta se měří detektory s kapalnými scintilátory. Vzorek se rozpustí v roztoku obsahujícím jednu nebo více, často dvě organické fluorescenční látky (primární a sekundární scintilátory). Část kinetické energie ionizujícího záření je převáděna na fotony viditelného záření, které jsou snímány fotonásobičem a převáděny na elektrické impulzy. Při použití detektoru s kapalným scintilátorem by měla být provedena korekce na zhášecí efekt.

Při měření aktivity radionuklidů musí být zajištěno, aby geometrické podmínky pro měřený zářič i pro referenční zářič byly totožné (stejné objemy nádob i roztoků). Výsledky všech měření se korigují na pozadí detekčního přístroje způsobeném přirozenou radioaktivitou prostředí a falešnými impulzy vznikajícími v samotném detekčním zařízení.

Při měření radionuklidů o vysokých aktivitách některými přístroji je třeba korigovat výsledky na ztrátu četnosti impulzů v důsledku časového rozlišení (mrtvé doby) detekčního zařízení a připojeného elektronického zařízení. Pro detekční systém s danou mrtvou dobou τ platí vztah:

N=N01-N0τ ,

v němž značí:

N - skutečnou četnost impulzů za sekundu,

N 0 - změřenou četnost impulzů za sekundu,

τ - mrtvou dobu v sekundách.

Je zřejmé, že takováto korekce bude přijatelně malá pouze v případě, že bude mít součin N 0 τ nízkou hodnotu. U některých přístrojů je tato korekce prováděna automaticky. Korekce četnosti na mrtvou dobu se provádí dříve než korekce na pozadí.

Výsledky stanovení radioaktivity vykazují odchylky, které pocházejí hlavně z náhodné povahy jaderných přeměn. Pro kompenzaci odchylek v počtu přeměn na jednotku času musí být zaznamenán dostatečný počet impulzů. K dosažení směrodatné odchylky menší než 1 % je třeba minimálně 10 000 impulzů. Všechny údaje o obsahu radioaktivity by měly být provázeny údaj i o datu, příp. hodině, kdy bylo měření provedeno. Při měření radioaktivity rozpuštěného vzorku se radioaktivita přepočítává na původní objem roztoku a vztahuje se na jednotku objemu, aby vyjadřovala objemovou aktivitu (koncentraci radioaktivity).

Radionuklidová čistota

Radionuklidová čistota přípravku, a tudíž totožnost každého přítomného radionuklidu musí být známá. Všeobecně nejpoužívanější metodou zkoušky na radionuklidovou čistotu je gama spektrometrie. Není to úplně spolehlivá metoda, protože nečistoty emitující záření beta nejsou obvykle detegovatelné. Použijí-li se NaI detektory, jsou píky nečistot často překryty spektrem hlavního radionuklidu.

Jednotlivé články předpisují požadavky na radionuklidovou čistotu (např. spektrum gama by se nemělo výrazně lišit od spektra referenčního přípravku) a mohou udávat limity pro určité radionuklidové nečistoty (např. kobalt-60 v kobaltu-57). Ačkoli tyto požadavky jsou nezbytné, samy o sobě nezaručují, že radionuklidová čistota přípravku je vhodná pro humánní použití. Výrobce musí provádět podrobné zkoušení svých výrobků, zvláště u přípravků radionuklidů s krátkým poločasem přeměny a dostatečně odeznělou aktivitou, na nečistoty s dlouhým poločasem přeměny. Touto cestou se získávají informace o vhodnosti jednotlivého výrobního procesu a správnosti jeho zkušebních postupů.

Radiochemická čistota

Stanovení radiochemické čistoty spočívá v oddělení různých chemických látek obsahujících radionuklid a v odhadu radioaktivity spojené s deklarovanými chemickými látkami. Ke stanovení radiochemické čistoty může být použita jakákoliv analytická separace, avšak s přihlédnutím k rychlosti a jednoduchosti se stala nejvhodnější chromatografie na plošných nosičích (papír nebo tenká vrstva) a pro určité přípravky elektroforéza (papír nebo vrstva acetatu celulosy). U technických popisů těchto analytických metod, obsažených v lékopise, musí být uvedeny speciální bezpečnostní předpisy pro práci s radioaktivními látkami.

Jak je uvedeno v obecných statích pro chromatografii, objem naneseného vzorku na start má být nejvýše 10 μl. Je vhodné neředit zkoušený přípravek, ale je důležité nanést takové množství radioaktivity, při němž ještě nedochází ke ztrátě četnosti impulzů v důsledku mrtvé doby přístroje. Při stanovení velmi malého množství radioaktivních látek se může přidat nosič, pokud je to uvedeno v jednotlivých článcích. Po vyvinutí se vrstva (chromatogram) usuší a poloha radioaktivních ploch se deteguje měřením radioaktivity podél celého chromatogramu za použití vhodného kolimátoru nebo nastříháním proužků a měřením jednotlivých částí chromatogramu. Poloha skvrn nebo ploch se může stanovit i porovnáním s neradioaktivními roztoky o stejném chemickém složení vizuálně pomocí barevných reakcí nebo hodnocením v ultrafialovém světle. Přímé barevné reakce nejsou vždy možné nebo žádoucí, protože postřik zvýrazňujícími látkami může způsobit difuzi radioaktivních látek mimo skvrnu či plochu.

Aktivitu lze měřit za použití integrátoru a zapisovače nebo digitálního počítače. Poměry ploch píků jsou úměrné poměrům radioaktivních koncentrací chemických látek. Pokud jsou chromatogramy nastříhány na jednotlivé části, poměry množství změřené radioaktivity jsou úměrné příslušné chemické formě radioaktivních látek.

Měrná radioaktivita

Měrná aktivita se obvykle počítá z objemové aktivity (koncentrace radioaktivity) a z koncentrace sledované chemické látky. Nejprve je však třeba ověřit, že radioaktivita odpovídá pouze danému radionuklidu (radionuklidová čistota) a dané chemické látce (radiochemická čistota).

Sterilita

Radiofarmaka určená pro parenterální podávání musí být připravena podle předpisů vylučujících mikrobiální znečištění a zaručujících sterilitu. Zkouška sterility se provádí podle předpisu uvedeného v obecné stati (2.6.1). U radiofarmak vznikají určité problémy v důsledku malých velikostí šarží a nebezpečí ozáření. Před vydáním povolení k použití určité šarže není vždy možné čekat na výsledky zkoušky sterility a zkoušku potom tvoří kontrola kvality výroby.

Přestože v článku Parenteralia jsou požadavky na použití protimikrobních přísad, jejich přídavek k radiofarmakům určeným k opakovanému podávání není závazný, pokud to není předepsáno v článku.

Pyrogenní látky

Pro určité přípravky je zkouška na pyrogenní látky předepsána, ale protože radionuklidy přítomné v přípravku mají obvykle krátký poločas přeměny a dost vysokou radioaktivitu, je obtížné provést zkoušku na pyrogenní látky před vydáním povolení k použití šarže. Aby se zabránilo hypertermii, která může být způsobená ne pyrogenními látkami, ale radioaktivitou přípravku, je někdy nutné počkat, až radioaktivita klesne na hodnotu předepsanou v článku a je taková, že může být podán předepsaný objem radioaktivního roztoku. Nehledě na tyto detaily se zkouška provádí v souladu s obecnou statí (2.6.8), při dodržení nezbytných předpisů radiační ochrany pracovníků provádějících zkoušku; zkouška je součástí kontroly kvality výroby. Výrobci se doporučuje předem si ověřit nepřítomnost pyrogenních látek ve výchozích látkách pro výrobu radiofarmak.

Předepsaná zkouška může být pro některá radiofarmaka nevhodná. Nemusí být například dostatečně citlivá pro přípravky podávané do páteřního kanálu nebo je nevhodná, jestliže se zkouška provádí po vydání povolení k použití. V těchto případech může být použita zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14).

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech na vhodně stíněném místě, aby pracovníci byli chráněni před primárním nebo sekundárním zářením, a které vyhovuje národním i mezinárodním předpisům týkajícím se uchovávání radioaktivních látek. Následkem ozařování mohou obaly a roztoky během uchovávání ztmavnout, toto ztmavnutí však nutně neznamená zhoršení kvality přípravků.

Radiofarmaka jsou určena k rychlé spotřebě.

Označování

V označení na obalu se uvede:

- název přípravku,

- jméno výrobce,

- identifikační číslo,

- pro kapalné přípravky: celková radioaktivita ve vnitřním obalu (lahvičce) nebo koncentrace radioaktivity v mililitru, vztažená k referenčnímu datu, a je-li třeba i k hodině, a objem kapaliny ve vnitřním obalu,

- pro tuhé přípravky, jako jsou lyofilizáty: celková radioaktivita vztažená k referenčnímu datu, a je-li třeba i k hodině,

- pro tobolky: radioaktivita každé tobolky vztažená k referenčnímu datu, a je-li třeba i k hodině, a počet tobolek v obalu,

- že přípravek je určen do rukou lékaře,

- způsob podávání,

- doba použitelnosti,

- název a koncentrace přidaných protimikrobních přísad,

- jakékoli zvláštní podmínky skladování.

Tabulka fyzikálních charakteristik radionuklidů obsažených v lékopise

⟪TABLE:tbl_001⟫

a maximální energie částic beta

b maximální počet fotonů na 100 přeměn odpovídající úplné anihilaci ve zdroji

e A Augerovy elektrony

e c konverzní elektrony

(*) Přesné hodnoty nejsou dosud známy.

Aquae tritiatae[ 3 H] solutio iniectabilis⟪MEDIA:img_001⟫

Injekce s tritiovanour[ 3 H] vodou

Je to voda na injekci, ve které některé molekuly vody obsahují atom tritia na místě vodíkového atomu. Přípravek může být izotonizován přídavkem chloridu sodného. Tritium[ 3 H] se může získat ozařováním lithia neutrony. Přípravek obsahuje 90,0 % až 110,0 % deklarované radioaktivity tritia k referenčnímu datu uvedenému v označení.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá kapalina.

Tritium má poločas přeměny 12,3 roku a emituje záření beta.

Zkoušky totožnosti

Zaznamená se spektrum záření beta způsobem uvedeným ve zkoušce Radionuklidová čistota. Spektrum zkoušeného přípravku se významně neliší od spektra referenčního přípravku tritiované[ 3 H] vody. Referenční přípravek tritiované[3H] vody se získává od národní laboratoře. Maximum energie záření beta je při 0,019 MeV.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 7,0.

Radionuklidová čistota.

A. 100 μl vhodně zředěného zkoušeného přípravku se smíchá s 10 ml scintilačního roztoku obsahujícího 1000 ml dioxanu R, 100 g naftalenu R, 7 g difenyloxazolu R a 0,3 g methylfenyloxazolylbenzenu R. Použijí se zkoumadla analytické čistoty vhodná pro kapalinovou scintilační spektrometrii. Změří se radioaktivita směsi na kapalně scintilačním spektrometru s diskriminátorem. Při nejnižším nastavení diskriminátoru je četnost asi 5000 impulzů/min. Změří se počet impulzů při různých nastaveních diskriminátoru. Při každém měření se vezme minimálně 10 000 impulzů v časovém intervalu nejméně 1 min. Za stejných podmínek se ihned změří referenční přípravek tritiované[ 3 H] vody, který má přibližně stejnou radioaktivitu.

Na semilogaritmický papír se vynese počet impulzů (upravený na pozadí) proti nastavení diskriminátoru. Vertikální vzdálenost křivky zkoušené látky a křivky referenčního přípravku j e konstantní a odpovídá matematickému vztahu:

A1B1-A2B2A1B1 . 100<20,

v němž značí:

A 1 - aktivitu referenčního přípravku při nejnižším nastavení diskriminátoru,

B 1 - aktivitu zkoušeného přípravku při nejnižším nastavení diskriminátoru,

A 2 - aktivitu referenčního přípravku při nastavení dlskriminátoru A 2 ≈ A 1 . 10 -3 ,

B 2 - aktivitu zkoušeného přípravku při stejném nastavení diskriminátoru.

B. Změří se spektrum gama. Přístroj zaznamená pouze radioaktivitu pozadí.

Radiochemická čistota. Do skleněné aparatury pro stanovení destilačního rozmezí (2.2.11) se umístí množství zkoušeného přípravku odpovídající asi 74 kBq zředěné vodou R na 50 ml. Stanoví se radioaktivní koncentrace způsobem popsaným v článku Radiofarmaca. Destiluje se do získání asi 25 ml destilátu. Vhodným bezpečnostním opatřením je třeba zabránit kontaminaci vzduchu. Je-li zkouška prováděna v digestoři, musí se chránit před průvanem. Stanoví se radioaktivní koncentrace destilátu a kapaliny zbylé v destilační nádobě. Hodnota radioaktivní koncentrace změřená po destilaci se neliší o více než 5 % od hodnoty radioaktivní koncentrace změřené před destilací. Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu uvedené v článku Radiofarmaca.

Stanovení radioaktivity

Stanoví se kapalinovou scintilační spektrometrií způsobem uvedeným v článku Radiofarmaca.

Uchovávání

Viz článek Radiofarmaca.

Označování

Viz článek Radiofarmaca.

Chromii[ 51 Cr] edetatis solutio iniectabilis ⟪MEDIA:img_001⟫

Injekce s edetanem chromu[ 51 Cr]

Je to sterilní roztok obsahující chrom-51 ve formě komplexu chromu (III) s kyselinou ethylendiamintetraoctovou, která je v přebytku. Může být izotonizován přídavkem chloridu sodného a může obsahovat vhodné protimikrobní přísady, jako je benzylalkohol. Chrom-51 je radioaktivní izotop chromu, který může být připraven ozařováním chromu přírodního izotopového složení nebo obohaceného chromem-50 neutrony. Obsahuje 90,0 % až 110,0 % deklarované radioaktivity chromu-51 k referenčnímu datu a hodině uvedeným v označení. Nejméně 95 % radioaktivity odpovídá chromu-51 ve formě edetanu chromu. Přípravek obsahuje proměnlivé množství chromu (Cr) nepřevyšující 1 mg v mililitru.

Vlastnosti

Čirý fialový roztok.

Chrom-51 má poločas přeměny 27,7 dne a emituje záření gama.

Zkoušky totožnosti

A. Vhodným přístrojem se zaznamená spektrum záření gama způsobem uvedeným v článku Radiofarmaca. Spektrum se významně neliší od spektra referenčního roztoku chromu-51. Referenční roztok chromu-51 se získává od národní laboratoře. Fotony gama mají energii 0,320 MeV.

B. Hodnotí se elektroforeogram získaný ve zkoušce Radiochemická čistota. Rozdělení radioaktivity je zároveň zkouškou totožnosti přípravku.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 3,5 až 6,5.

Radionuklidová čistota. Vhodným přístrojem se zaznamená spektrum záření gama způsobem uvedeným v článku Radiofarmaca. Spektrum se významně neliší od spektra referenčního roztoku chromu-51.

Radiochemická čistota. Stanoví se zónovou elekroforézou (2.2.31) za použití papírového pruhu jako nosiče (vhodný použitý papír má hmotnost 120 g/m 2 , tloušťku 0,22 mm a kapilární stoupání 105 mm až 115 mm/30 min). Jako elektrolyt se použije roztok obsahující barbital sodnou sůl R (0,2 g/l) a dusičnan sodný R (10 g/l).

Na papír se nanese 10 μl zkoušeného přípravku do 3mm proužku ve vzdálenosti 10 cm od katody. Pod stabilizovaným proudem s elektrickým polem asi 30 V/cm se vyvíjí po dobu 30 min. Edetan chromu[ 51 Cr] se posune asi 5 cm k anodě, chroman[ 51 Cr] se posune asi 10 cm k anodě a chromitý[ 51 Cr] iont se posune asi 7 cm ke katodě. Vhodným detektorem se stanoví rozdělení radioaktivity. Nejméně 95 % celkové radioaktivity je v proužku odpovídajícím edetanu chromu[ 51 Cr],

Chrom. Připraví se porovnávací roztok chromu (1 mg Cr/ml) takto: 0,96 g síranu draselnochromitého R a 2,87 g edetanu disodného R se rozpustí v 50 ml vody R, 10 min se povaří, ochladí se, pomocí hydroxidu sodného zředěného RS se upraví pH na hodnotu 3,5 až 6,5 a zředí se vodou R na 100,0 ml. Změří se absorbance (2.2.25) zkoušeného přípravku a porovnávacího roztoku při 560 nm. Hodnota absorbance zkoušeného přípravku nepřevyšuje absorbanci porovnávacího roztoku.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu uvedené v článku Radiofarmaca. Přípravek se může použít před dokončením zkoušky.

Stanovení radioaktivity

Změří se radioaktivita postupem popsaným v článku Radiofarmaca a porovná se za použití vhodného zařízení s referenčním roztokem chromu-51 nebo se změří na přístroji kalibrovaném pomocí tohoto roztoku.

Uchovávání

Viz článek Radiofarmaca.

Označování

Viz článek Radiofarmaca.

Cyanocobalamini[ 57 Co] capsulae ⟪MEDIA:img_001⟫

Tobolka s kyanokobalaminem[ 57 Co]

Je to tobolka obsahující kyanid [ 57 Co]-α-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)kobamidu. Může obsahovat vhodné pomocné látky. Kobalt-57 je radioaktivní izotop kobaltu, který může být vyroben ozařováním niklu protony o vhodné energii. Kyanokobalamin[ 57 Co] může být připraven růstem vhodných mikroorganismů v prostředí obsahujícím[ 57 Co]kobaltový iont. Nejméně 90 % kobaltu-57 je ve formě kyanokobalaminu. Tobolky vyhovují požadavkům na tvrdé tobolky uvedeným v článku Capsulae, pokud není uvedeno a schváleno jinak.

Vlastnosti

Tvrdé želatinové tobolky.

Kobalt-57 má poločas přeměny 271 dní a emituje záření gama.

Zkoušky totožnosti

A. Vhodným přístrojem se zaznamená spektrum záření gama způsobem popsaným v článku Radiofarmaca. Spektrum se významně neliší od spektra referenčního roztoku kobaltu-57. Referenční roztok kobaltu-57 a referenční roztok kobaltu-58 se získávají od národní laboratoře. Nejvíce zastoupené fotony gama kobaltu-57 mají energii 0,122 MeV.

B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Radiochemická čistota. Retenční čas hlavního píku na radiochromatogramu zkoušeného roztoku se prakticky shoduje s retenčním časem píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Radionuklidová čistota. Vhodným přístrojem se zaznamená spektrum záření gama způsobem popsaným v článku Radiofarmaca za použití vhodného zařízení kalibrovaného pomocí referenčních roztoků kobaltu-57 a kobaltu-58. Spektrum se významně neliší od spektra referenčního roztoku kobaltu-57. Stanoví se relativní obsah kobaltu-57, kobaltu-56 a kobaltu-58. Kobalt-56 má poločas přeměny 78 dní a jeho přítomnost dokazují fotony gama o energii 0,847 MeV. Kobalt-58 má poločas přeměny 70,8 dne a jeho přítomnost dokazují fotony gama o energii 0,811 MeV. Z celkové radioaktivity připadá nejvýše 0,1 % na kobalt-56, kobalt-58 a další radionuklidová nečistoty.

Radiochemická čistota. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Obsah tobolky se rozpustí v 1,0 ml vody R a nechá se 10 min stát. Potom se centrifuguje 10 min při 2000 otáček/min a použije se vrchní tekutina.

Porovnávací roztok. 10 mg kyanokobalaminu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100 ml. 2 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 100 ml. Použitelnost roztoku je 1 h.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů methanolu R a roztoku hydrogenfosforečnanu sodného R (10 g/l) (26,5 + 73,5), jejíž pH bylo upravena na 3,5 kyselinou fosforečnou R. Průtoková rychlost je 1,0 ml/min. Směs lze použít do dvou dnů od přípravy,

- detektoru radioaktivity nastaveného na kobalt-57,

- spektrofotometrického detektoru při 361 nm,

- injektorové smyčky.

Nastříkne se odděleně po 100 μl každého roztoku. Zaznamená se chromatogram zkoušeného roztoku po dobu odpovídající trojnásobku retenčního času kyanokobalaminu a z ploch píků se vypočítá procentuální obsah kobaltu-57 přítomného jako kyanokobalamin.

Chromatogram porovnávacího roztoku se zaznamenává po dobu 30 min.

Rozpadavost. Tobolky vyhovují zkoušce rozpadavosti tablet a tobolek (2.9.1) s tím rozdílem, že se použije pouze jedna tobolka místo šesti.

Obsahová stejnoměrnost. Měří se jednotlivě radioaktivita nejméně deseti tobolek za použití vhodného zařízení za stejných geometrických podmínek. Vypočítá se průměrná radioaktivita jedné tobolky. Radioaktivita žádné tobolky se neliší od nalezené průměrné radioaktivity o více než ±10 %. Relativní směrodatná odchylka je menší než 3,5 %.

Stanovení radioaktivity

Průměrná radioaktivita zjištěná ve zkoušce Obsahová stejnoměrnost je 90,0 % až 110,0 % deklarované radioaktivity kobaltu-57 k referenčnímu datu uvedenému v označení.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C za podmínek uvedených v článku Radiofarmaca.

Označování

Viz článek Radiofarmaca.

Cyanocobalamini[ 57 Co] solutio ⟪MEDIA:img_001⟫

Roztok s kyanokobalaminem[ 57 Co]

⟪MEDIA:img_001⟫

Je to roztok obsahující kyanid [ 57 Co]-α-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)kobamidu. Může obsahovat stabilizační a protimikrobní přísady. Kobalt-57 je radioaktivní izotop kobaltu, který může být vyroben ozařováním niklu protony o vhodné energii. Kyanokobalamin[ 57 Co] může být připraven růstem vhodných mikroorganismů v prostředí obsahujícím [ 57 Co]kobaltový iont. Přípravek obsahuje 90,0 % až 110,0 % deklarované radioaktivity kobaltu-57 k referenčnímu datu uvedenému v označení. Nejméně 90 % kobaltu-57 je ve formě kyanokobalaminu.

Vlastnosti

Čirý bezbarvý nebo slabě růžový roztok.

Kobalt-57 má poločas přeměny 271 dní a emituje záření gama.

Zkoušky totožnosti

A. Vhodným přístrojem se zaznamená spektrum záření gama způsobem uvedeným v článku Radiofarmaca, které se významně neliší od spektra referenčního roztoku kobaltu-57. Referenční roztok kobaltu-57 a referenční roztok kobaltu-58 se získávají od národní laboratoře. Nejvíce zastoupené fotony gama kobaltu-57 mají energii 0,122 MeV.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 4,0 až 6,0.

Zobrazuje sa skrátený text. Úplné znenie je dostupné v interaktívnom prehliadači LexHub na tejto adrese.